German Title: Entschlüsselung der möglichen Rolle der entfalteten Protein Antwort bei Glioblastom

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Abstract

The unfolded protein response (UPR) plays a significant role in reducing the burden of protein from the endoplasmic reticulum (ER) of cells by enhancing the expression of factors which facilitate protein folding, such as chaperones and isomerases, while simultaneously reducing translation and initiating ER-associated degradation pathways. When confronted with adverse conditions in their microenvironment, tumor cells need to adapt their proteomes by producing and secreting factors which support their survival and growth. This results in the generation of ER stress conditions that leads to activation of the UPR pathway. UPR has been linked to almost every type of cancer including grade IV glioma, glioblastoma, a devastating disease with patients surviving on average only 15 months after diagnosis. One of the reasons for this poor prognosis is the ability of glioblastoma to induce early angiogenesis followed by invasion of the normal brain parenchyma. This PhD thesis focuses on understanding how UPR is regulated in glioblastoma and how this contributes to tumor angiogenesis. To this end, the UPR pathway in glioblastoma cell lines was first characterized using artificial ER stress inducers. As hypoxia is the leading physiological inducer of UPR while also regulating the early events of glioblastoma progression, the UPR branches that are activated under hypoxia were investigated. PKR-like kinase (PERK), a UPR sensor protein which controls the translation machinery of tumor cells under ER stress was examined in detail, and it was determined whether this protein is involved in the regulation of expression and secretion of any angiogenic proteins in glioblastoma. For this purpose, proteomic analysis of the conditioned media of LN308 glioblastoma cells with and without PERK inhibition was performed and PERK-regulated secretory factors were identified. Among the hits was Peptidyl-glycine alpha-amidating monooxygenase (PAM), a transmembrane protein which plays a role in the rate-limiting final step of the activation of various neuropeptides, including the angiogenic peptide adrenomedullin (ADM). PAM was validated as a pro-angiogenic factor for glioblastoma, its regulation by hypoxia (HIF1α) was characterized, and the importance of PERK kinase activity for the generation of a small soluble cytosolic cleaved product of PAM (PAM-sfCD), which has the ability to induce potential gene expression changes favoring glioblastoma progression, was shown. PAM was also found to have mesenchymal-subtype specific expression in glioblastoma, where AP-1 was found to be the leading transcription factor regulating PAM transcripts. The in vivo study in this thesis illustrates the importance of PAM for glioblastoma growth kinetics in an orthotopic xenotransplanted mouse model, revealing an increased overall survival of animals upon PAM knockdown. Supporting this, clinical data suggest better survival of glioblastoma patients with lower expression of PAM. Thus, this work reveals the importance of the PERK-mediated expression and post-translational modification of PAM for angiogenesis and tumor progression in glioblastoma, introducing the protein as a novel anti-angiogenic therapeutic target in this deadly disease.

Translation of abstract (German)

Die Reaktion auf entfaltete Proteine (engl. Unfolded protein response, UPR) spielt eine bedeutende Rolle bei der Verringerung der Proteinausschüttung aus dem endoplasmatischen Retikulum (ER), indem unter anderem die Expression von Chaperonen und Isomerasen verstärkt wird, während gleichzeitig die Translation reduziert und ER-assoziierte Abbau Wege initiiert werden. Aufgrund veränderter Bedingungen in der unmittelbaren Umgebung, passen Tumorzellen ihr Proteom durch die Produktion und Sekretion bestimmter Faktoren, die das Überleben und das Wachstum unterstützen, an. Hierzu zählt beispielweise die Bildung eines Stresszustands des ER, der zur Aktivierung des UPR-Signalwegs führt. Die Aktivierung des UPR lässt sich bei fast jeder Krebsart, einschließlich dem Glioblastom, einem Gliom Grad IV, dessen Standardtherapie aus Tumorresektion gefolgt von Chemo- und Radiotherapie besteht, finden. Die schlechte Prognose des Glioblastoms lässt sich durch den frühen Beginn der Angiogenese, die zur Invasion in das gesunde Gehirnparenchym führt, erklären. Die vorliegende Doktorarbeit beschäftigt sich mit der Fragestellung, wie UPR-Aktivierung im Glioblastom reguliert wird und diese zur Tumorangiogenese beiträgt. Hierzu wurde zunächst der UPR-Signalweg in verschiedenen Glioblastomzelllinien mit ER-Stress induzierenden Reagenzien charakterisiert. Mittels Hypoxie, welches zu den stärksten physiologischen UPR-Auslösern zählt und zusätzlich die frühen Ereignisse der Glioblastomentwicklung reguliert, wurden die aktivierten UPR-Signalwege identifiziert. In diesem Zusammenhang wurde das UPR-Sensorprotein PKR-like Kinase (PERK), welches die Translation in Tumorzellen unter ER-Stress steuert, charaktisiert und der Effekt auf die Regulierung eines angiogenen Proteins in Glioblastomen untersucht. Um dies herauszufinden, wurde eine Proteomanalyse des konditionierten Mediums von LN308-Glioblastomzellen mit bzw. ohne PERK-Inhibierung durchgeführt und die von PERK regulierten sekretorische Faktoren identifiziert. Dabei wurde das Transmembranprotein Peptidyl-Glycin-alpha-amidierende Monooxygenase (PAM), das eine signifikante Rolle im geschwindigkeitsbestimmenden letzten Schritt der Aktivierung von Neuropeptiden und Adrenomedullin (ADM) spielt sowie an der Angiogenese beteiligt ist, gefunden. PAM wurde als pro-angiogener Faktor in Glioblastomen validiert, dessen Regulierung durch Hypoxie (HIF1α) charakterisiert und die Bedeutung der PERK-Kinase-Aktivität für die Entstehung eines löslichen Spaltprodukts von PAM (PAM-sfCD) im Cytosol gezeigt. PAM-sfCD trägt zu einer Veränderung der Genexpression zugunsten der Entwicklung von Glioblastomen bei. Zusätzlich weist PAM eine erhöhte Proteinexpression im mesenchymalen Subtyp von Glioblastomen auf, wobei AP-1 der ausschlaggebende Faktor bei der Regulierung der Transkription von PAM ist. Eine in vivo Studie veranschaulicht die Bedeutung von PAM für das Glioblastomwachstum an Hand eines orthotopisch, xenotransplantierten Mausmodell und zeigt ein verlängertes Überleben von Tieren mit PAM-Knockdown. Dies wird von klinischen Daten, welche das ZUSAMMENFASSUNG xvi verlängerte Überleben von Glioblastompatienten mit niedrigerer PAM Expression in Verbindung bringen, unterstützt. Die vorliegende Doktorarbeit hebt daher die Bedeutung der PERK-vermittelte Expression und der posttranslationalen Modifikation von PAM mit einem Fokus auf die angiogenen Vorteile hinsichtlich der Tumorentwicklung, hervor und unterstreicht somit die Relevanz von PAM als anti-angiogenes Ziel für die Therapie von Glioblastomen.