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Abstract

The spatial organisation of the genome is essential for its functions including gene expression, DNA replication and repair, as well as chromosome compaction and segregation. Below the level of the large linear chromosomal DNA molecules, more compact topologically associating domains (TADs) have been identified as fundamental units of chromosome structure. However, the actual three-dimensional (3D) folding of DNA within TADs still needs to be understood.

Based on theoretical simulations, we predicted that the nanoscale resolving power of super-resolution microscopy can in principle address this key open question. Here, we present the development of an experimental approach that combines super-resolution microscopy with Exchange-PAINT of barcoded in situ hybridisation probes and their computational analysis to extract the 3D path of the linear DNA sequence underlying TADs. We demonstrate that this method can resolve the physical structure of the DNA at a resolution of ~500 bp in vitro and ~10 kb in single human cells. Given the predicted genomic loop sizes and our ability to reconstruct the physical DNA path from the positions of combinatorial in situ hybridisation labels, the experimental and computational pipeline developed in this thesis is ready to be scaled-up to probe the 3D organisation of entire chromosomes at ~10 kb resolution in single human cells.

Translation of abstract (German)

Die räumliche Organisation des Genoms ist für seine Funktionen wie Genexpression, DNA-Replikation und -Reparatur sowie Chromosomenkompaktierung und -segregation von entscheidender Bedeutung. Den großen linearen chromosomalen DNA-Molekülen sind kompaktere, topologisch assoziierende Domänen (TADs) untergeordnet, die als grundlegende Einheiten der Chromosomenstruktur identifiziert wurden. Die tatsächliche dreidimensionale Faltung der DNA innerhalb von TADs muss jedoch noch aufgeklärt und verstanden werden.

Basierend auf theoretischen Simulationen sollte das nanoskalige Auflösungsvermögen höchstauflösender Mikroskope prinzipiell diese Verständnislücke füllen können. Wir präsentieren hier die Entwicklung eines experimentellen Verfahrens, das höchstauflösende Mikroskopie mit dem PAINT-Austausch von barcodierten In-situ-Hybridisierungssonden und computergestützter Analyse ihrer Lokalisation kombiniert, um den 3D-Pfad der den TADs zugrunde liegenden linearen DNA-Sequenz zu extrahieren. Wir zeigen, dass diese Methode die physikalische Struktur der DNA bei einer Auflösung von ~500 bp in vitro und ~10 kb in einzelnen menschlichen Zellen darstellen kann. Basierend auf den vorhergesagten Genomschleifengrößen und unserer Fähigkeit, den physikalischen Pfad der DNA aus den Positionen kombinatorischer In-situ-Hybridisierungsmarkierungen zu rekonstruieren, kann nun die in dieser Arbeit entwickelte experimentelle und rechnerische Pipeline für die Untersuchung der 3D-Organisation ganzer Chromosomen bei einer Auflösung von ~10 kb in individuellen menschlichen Zellen hochskaliert werden.