Molekulare Methoden zum Nachweis des oral-probiotischen Stammes Streptococcus salivarius ssp. salivarius K12 und Anwendung in vitro und in vivo

Meinelt, Anica; Conrads, Georg

doi:1561

Molekulare Methoden zum Nachweis des oral-probiotischen Stammes Streptococcus salivarius ssp. salivarius K12 und Anwendung in vitro und in vivo = Molecular methods for detection of oral probiotic Streoptococcus salivarius ssp. salivarius strain K12 and application in vitro and in vivo

Meinelt, Anica (Author)

2006

Verantwortlichkeitsangabevorgelegt von Anica Koll

ImpressumAachen : Publikationsserver der RWTH Aachen University 2006

Umfang118 S. : Ill., graph. Darst.

Aachen, Techn. Hochsch., Diss., 2006

Genehmigende Fakultät
Fak10

Hauptberichter/Gutachter
Conrads, Georg (Thesis advisor)

Tag der mündlichen Prüfung/Habilitation
2006-07-24

Online
URN: urn:nbn:de:hbz:82-opus-15614
URL: https://publications.rwth-aachen.de/record/61320/files/Meinelt_Anica.pdf

Einrichtungen

Medizinische Fakultät (510000-1)

Inhaltliche Beschreibung (Schlagwörter)
Medizin (frei) ; Streptococcus salivarius (frei) ; Probiotikum (frei) ; Pharyngitis (frei) ; probiotic (frei)

Thematische Einordnung (Klassifikation)
DDC: 610

Kurzfassung
S. salivarius gehört zur Gruppe der Viridansstreptokokken und ist ein natürlicher Besiedler der Mundhöhle. Er zählt zu den Produzenten von Bacteriocin-like-inhibitory-substances (BLIS) - antibiotische Peptide, die von grampositiven Bakterien synthetisiert werden und einen wachstumsregulierenden Effekt auf nahverwandte Bakterienarten haben. Über eine ausgeprägte inhibitorische Wirkung gegenüber dem Pharyngitiserreger S. pyogenes verfügt der Stamm S. salivarius ssp. salivarius K12 - Produzent des Lantibiotikums Salivaricin A2. S. pyogenes, der ß-hämolytisch und in der Serogruppe A ist, wirkt via Tröpfcheninfektion obligat humanpathogen und verursacht das Krankheitsbild der Tonsillopharyngitis. Mögliche schwerwiegende Folgeerkrankungen sind die Glomerulonephritis und das rheumatische Fieber. Besonders gefährdet sind Kinder im Alter von vier bis zwölf Jahren. Um vom Benefit des oral-probiotischen Stammes K12 gegen S. pyogenes zu profitieren, bedarf es eines ausreichend sensitiven und spezifischen Nachweises für S. salivarius ssp. salivarius K12, um diesen in einem mit ihm angereicherten Nahrungsmittel oder in der Umwelt nachweisen zu können. In der vorliegenden Studie wurde zunächst eine artspezifische PCR auf Basis des Dextranasegens zum Nachweis von S. salivarius entwickelt. Nach Optimieren der Parameter war für 72 Prozent der untersuchten S.-salivarius-Stämme ein reproduzierbarer Nachweis möglich. Weiterhin wurde eine stammspezifische Nachweismethode für den Industriestamm S. salivarius ssp. salivarius K12 etabliert. Das Verfahren wurde in vitro und in vivo mittels Untersuchung des Kolonisationsverhaltens durch BLIS-K12-Throat-Guard bei einem einzelnen Probanden getestet. Basierend auf der Genbank-Salivaricin-A-Operonsequenz von S. salivarius 20P3 wurden zunächst konservierte Primer für die Amplifikation und Sequenzierung des salA-Strukturgens und Teile des salB-Strukturgens des Stammes S. salivarius ssp. salivarius K12 entwickelt. Mit Hilfe der gewonnenen Daten wurden drei K12-stammspezifische PCR-Methoden entwickelt: Eine konventionelle einstufige PCR, eine zweistufige Nested-PCR sowie eine quantitative real-time (RTQ-) PCR. Die Daten zeigen, dass die stammspezifische einstufige PCR eine adäquate Detektionsform für S. salivarius ssp. salivarius K12 während der aktiven Zuführung des Stammes in die Mundhöhle darstellt. Eine weitere Anwendung dieser PCR ist die Untersuchung von Patienten auf eine bestehende Kolonisation mit dem Stamm bei ausreichender Quantität. Um die Sensitivität zu steigern und eine mögliche Besiedlung der Mundhöhle nach der aktiven Kolonisationsphase mit S. salivarius ssp. salivarius K12 zu erfassen, wurde die stammspezifische Nested-PCR eingesetzt. Sie ermöglicht den Nachweis einer geringeren Zellzahl und bietet somit ein adäquates Nachweisverfahren mit ausreichender Sensitivität, Spezifität und Reproduzierbarkeit zur Untersuchung von S. salivarius ssp. salivarius K12. Allerdings muss bei der zweistufigen PCR die Validität durch maximale Kontaminationsprophylaxe während der Laborabläufe gesichert werden. Als weitere Methode wurde eine stammspezifische quantitative real-time (RTQ-) PCR etabliert. Dieses sensitive und spezifische Nachweisverfahren bewirkt im Vergleich zur Nested-PCR ein kontaminationssichereres Arbeiten und die direkte quantitative Bestimmung der Salivaricin-A-Amplifikate anhand von Standardkurven. Mit Hilfe der Nested-PCR sowie der quantitativen real-time PCR konnte eine Besiedlung der Mundhöhle des Probanden mit S. salivarius ssp. salivarius K12 im Pharynx, auf der Zunge sowie im Speichel bis zum 22. Untersuchungstag nachgewiesen werden. Eine Substitution mit S. salivarius ssp. salivarius K12 sollte nach Analyse der vorliegenden Ergebnisse nach drei Wochen wiederholt werden, um eine längerfristige Protektion vor S.-pyogenes-Kolonisation und -Infektion zu erzielen.

S. salivarius belongs to the viridans group streptococci and is a predominant inhabitant of the oral cavity. It produces bacteriocin-like inhibitory sustances (BLIS) - antimicrobial peptides that inhibit the growth of closely related bacteria. S. salivarius ssp. salivarius strain K12 is highly active against S. pyogenes with lantibiotic salivaricin A2. S. pyogenes, which is ß-hemolytic and in serogroup A, causes pharyngeal infections, particularly in children aged four to twelve, and occasionally complications as acute rheumatic fever and acute glomerulonephritis. To profit by the benefits of oral probiotic strain K12, it is important to be able to monitor K12 in a product or the environment with a highly sensitive and specific method. For this reason, first of all a species specific PCR on basis of the gene, encoding for dextranase, was tested in this study. 72 percent of the tested S. salivarius strains were detected. Furthermore, a strain specific method for detection of the industrial strain S. salivarius ssp. salivarius K12 was developed. The method was tested in vitro and in vivo by colonization of a single representative individual with BLIS K12 Throat Guard. Based on salivaricin A operon information for S. salivarius 20P3, conserved primers for amplification and sequencing of gene salA and salB of S. salivarius K12 were designed. With the aid of the generated sequence fragment, three K12 strain specific PCR methods were developed: a conventional PCR, a nested PCR and a quantative real-time (RTQ-)PCR. Our data showed that conventional PCR offers a method for detection of S. salivarius K12 during phases of active colonization. In addition, patients can be tested on existing colonization with strain K12 as high quantaty is guarenteed. To increase sensitivity, a strain specific nested PCR was developed. This double round PCR is able to detect even a small number of K12 cells while specifity and reproducability are warranted. Avoidance of contamination has to be assured in the course of all laboratory processes. Futhermore, a strain specific real-time (RTQ-) PCR was established. The advantages in contrast to nested PCR are quantative determination of salivaricin A amplificats by using standard curves and safer working procedures in regard of contamination. Using nested PCR and real-time PCR, a colonization of the pharynx, the dorsum of the tongue and the saliva of the test person with S. salivarius ssp. salivarius strain K12 could be shown for as long as 22 days. In conclusion, repeated administration of S. salivarius ssp. salivarius strain K12 should be required at least every three weeks to achieve optimal probiotic effects against colonization and infection of S. pyogenes.

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