Inhaltszusammenfassung:
Einleitung: Neutrophile Granulozyten sind die im Körper am häufigsten vorkommenden Immunzellen und unverzichtbar für eine effektive Immunabwehr. Zentrale Funktionen der Neutrophilen werden durch G-Proteine des Subtyps Gi vermittelt, der jeweilige Beitrag der Isoformen Gi2 und Gi3 ist jedoch bisher unklar. Unter Einsatz der LysM-Cre- und der Ly6G-Cre Mauslinien wurden neue Mauslinien mit einem Neutrophilen-spezifischen Knockout für Gαi2 und/oder Gαi3 erzeugt. In dieser Arbeit sollte erstens die Effektivität des Knockouts der Proteine Gαi2 und/oder Gαi3 in den Neutrophilen dieser neuen Mauslinien ermittelt werden. Zweitens sollte der Einfluss des Neutrophilen-spezifischen Knockouts von Gαi2 und/oder Gαi3 auf die zelluläre Zusammensetzung von Knochenmark und Milz untersucht werden. Drittens sollte der jeweilige Beitrag der Isoformen Gαi2 und Gαi3 zur Phagozytose von Neutrophilen ermittelt werden.
Methoden: Im ersten Teil wurden Neutrophile aus Tieren der verschiedenen Mauslinien isoliert, mittels magnetic activated cell sorting (MACS) aufgereinigt und via PCR auf das Vorhandensein der Gene Gnai2 und/oder Gnai3 sowie via Western Blot auf das Vorhandensein der Proteine Gαi2 und/oder Gαi3 überprüft. Im zweiten Teil wurde im Durchflusszytometer der relative Anteil von Neutrophilen Granulozyten, Eosinophilen Granulozyten und Makrophagen in Einzelzellsuspensionen aus Knochenmark und Milz ermittelt. Im dritten Teil wurde in einem funktionellen ex vivo Assay die Phagozytose von fluoreszierenden Latexpartikeln durch Neutrophile, mit oder ohne vorhergehende Stimulation durch fMLP, im Durchflusszytometer quantifiziert.
Ergebnisse: Im ersten Teil konnte für die Mauslinien Gnai2 fl/fl LysM-Cre, Gnai3 fl/fl LysM-Cre und Gnai2 fl/fl Gnai3 fl/fl LysM-Cre eine effektive Deletion der Zielgene sowie eine Reduktion der Konzentrationen von Gαi2/Gαi3 um 66 – 78 % nachgewiesen werden. Für die Mauslinien Gnai2 fl/fl Ly6G-Cre und Gnai3 fl/fl Ly6G-Cre zeigte sich zwar eine effektive Deletion der Zielgene, jedoch keine Reduktion der Proteine Gαi2/Gαi3. Im zweiten Teil konnte in den Mauslinien Gnai2 fl/fl LysM-Cre, Gnai3 fl/fl LysM-Cre und Gnai2 fl/fl Gnai3 fl/fl LysM-Cre kein signifikanter Einfluss der Knockouts auf die relativen Häufigkeiten von Neutrophilen, Eosinophilen und Makrophagen in Knochenmark und Milz festgestellt werden. Im dritten Teil konnte unabhängig von der vorherigen Stimulation mit fMLP kein signifikanter Effekt des Knockouts von Gαi2 und/oder Gαi3 auf die phagozytische Aktivität der Neutrophilen festgestellt werden.
Diskussion: Die Effektivität des Knockouts von Gαi2 und/oder Gαi3 in den LysM-Cre Mauslinien war mit den in der Literatur für andere LysM-Cre vermittelte Knockouts angegebenen Effektivitäten vergleichbar. Der unzureichende Knockout von Gαi2/Gαi3 bei effektiver Deletion der entsprechenden Gene in den Ly6G-Cre Mauslinien lässt sich möglicherweise durch den späteren Zeitpunkt der Expression von Ly6G in der Entwicklung des Neutrophilen erklären. Die Ergebnisse des Assays zur Quantifizierung der phagozytischen Aktivität der Neutrophilen wiesen eine große interindividuelle Streuung auf, sodass bei der gegebenen Anzahl an untersuchten Versuchstieren nur ein sehr starker Effekt der Defizienz von Gαi2 und/oder Gαi3 hätte nachgewiesen werden können.
Fazit: Für die Mauslinien Gnai2 fl/fl LysM-Cre, Gnai3 fl/fl LysM-Cre und Gnai2 fl/fl Gnai3 fl/fl LysM-Cre konnte ein effektiver Knockout der Proteine Gαi2 und/oder Gαi3 in Neutrophilen Granulozyten ohne signifikanten Einfluss auf die zelluläre Zusammensetzung von Knochenmark oder Milz nachgewiesen werden. In den Mauslinien Gnai2 fl/fl Ly6G-Cre und Gnai3 fl/fl Ly6G-Cre fand kein effektiver Knockout der Proteine Gαi2/Gαi3 statt. Ein Effekt der Defizienz von Gαi2 und/oder Gαi3 auf die phagozytische Aktivität von Neutrophilen konnte nicht gezeigt werden.
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