Charakterisierung von otischen Stammzellen zur Entwicklung eines in vitro Modells vom Innenohr

Abstract

Hintergrund: Innenohrschwerhörigkeit ist die häufigste Sinnes- und Berufserkrankung weltweit. Ursächlich ist die Degeneration von Sinneszellen, den sensorischen Haarsinneszellen des Corti’schen Organs. Trotz des hohen Bedarfs stehen bisher keine kausalen Therapiemöglichkeiten zur Verfügung. Zur Etablierung eines Modells zum “Wirkstoffscreening” von otoprotektiven und ototoxischen Substanzen bietet sich die Verwendung von in vitro Kulturen an, da definierte Kulturparameter bei gleichzeitigem Verzicht eines aufwendigen in vivo Tiermodells besser kontrolliert werden können. Es konnte gezeigt werden, dass aus dem Innenohr der postnatalen Maus Progenitorzellen mit Stammzelleigenschaften isoliert und in vitro zur Bildung proliferierender Zellverbände (Sphären) stimuliert werden konnten. Die aus den Sphären differenzierten Zellverbände besitzen typische Merkmale von Haarsinnes- und Stützzellen des sensorischen Sinnesepithels und stellen den Ausgangspunkt zukünftiger Wirkstoffscreening-Verfahren dar. Trotz des Fortschritts muss diese Methode weiter optimiert und standardisiert werden. Stützzellen müssen als potenzielle Vorläuferzellen näher definiert und selektiert werden. Es wird vermutet, dass diese durch Inhibition des Notch-Signalwegs mittels γ-Sekretase-Inhibitor zur vermehrten Differenzierung in Haar- und Stützzellen angeregt werden können. Das optimierte in vitro Modell kann anschließend zu einem gezielten Haarzell-Schädigungsmodell erweitert werden. Zielsetzung: (I) Immunhistochemische Charakterisierung von verschiedenen Stützzellpopulationen mit Stammzelleigenschaften anhand ihrer CD-Markerexpression im Corti’schen Organ der postnatalen Maus (p3-5). (II) Etablierung von geeigneten Verfahren zur Zellsortierung: Magnet- (MACS) und Fluoreszenz-assoziierte Zellsortierung (FACS) zur Selektion der in (I) gefundenen Stützzellen. (III) Untersuchung von Sphärenbildungskapazität und Differenzierungspotenzial Corti’scher Stützzellen nach Zellsortierung und immunhistochemische Dokumentation des Stammzell- und Differenzierungscharakters. (IV) Untersuchung von Sphärenbildungskapazität und Differenzierungspotenzial Corti’scher Zellen nach chemischer Stimulation mit dem γ-Sekretase-Inhibitor L-685458 mit und ohne segmentale Trennung des neonatalen Corti’schen Organs. Ergebnisse: (I) Die CD-Markerexpression für den Neurotrophinrezeptor p75NTR wurde immunhistochemisch in der äußeren Pillarzelle, den Deiterszellen und den Hensenzellen nachgewiesen. Die Expression von dem Glutamat-Aspartat Transporter (GLAST) zeigte sich in der inneren Phalangenzelle sowie in Zellen des großen epithelialen Wulstes. (II) Mittels Durchflusszytometrie wurde gezeigt, dass MACS keine effiziente Anreicherung ermöglichte, mit FACS jedoch eine Selektion der beiden Stützzellpopulationen mit höchstem Reinheitsgrad erreicht werden konnte. (III) Im Vergleich zu unsortierten Zellen des Corti’schen Organs (Kontrolle) stieg die Sphärenbildungskapazität nach MACS in allen Zellfraktionen signifikant an, während die der FACS-sortieren Zellen reduziert war. Eine Verbesserung des Differenzierungspotenzials konnte innerhalb der MACS-Zellfraktionen, aber nicht im Vergleich zur Kontrolle erzielt werden. Qualitativ wurden Stammzell- (Nestin, Bmi1, Jag1) und Differenzierungsmarker (MyosinVIIa, Sox2, S100, E-Cadherin, FM1-43) in MACS- und FACS-sortierten Sphären nachgewiesen. (IV) Sphären aus nicht-segmental getrennten Corti’schen Zellen der Maus (p0) konnten durch Inhibition des Notch-Signalwegs zu einer signifikant gesteigerten und effizienten in vitro Differenzierung in Haar- und Stützzellen angeregt werden. Schlussfolgerung: MACS und FACS erwiesen sich zur Sortierung Corti’scher Zellen der postmortalen Maus als ungeeignet, da die Zellanreicherung mit einem geringen Reinheitsgrad, einem hohen Zellverlust und mit keiner wesentlichen Verbesserung des Differenzierungspotenzials in Stützzellen und Haarsinneszellen einherging. Mit der in vitro Inhibition des Notch-Signalwegs konnte die Kultivierung von Progenitorzellen aus dem Innenohr der neonatalen Maus jedoch optimiert werden. Die Ergebnisse dieser Arbeit können ergänzend mit einer in vitro Applikation von ototoxischen Substanzen wie Aminoglykosiden die Basis eines effizienten in vitro Modells vom Innenohr zur gezielten Haarzellregeneration oder Haarzelldegeneration schaffen.