Untersuchungen zur differentiellen Genexpression in der Leber von Connexin32-Knock-out- und Connexin32-Wildtyp-Mäusen sowie in Mauslebertumoren mit Mutationen im beta-Catenin- bzw. Ha-ras-Onkogen

Abstract

Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde die differentielle Genexpression in der Leber von PB-behandelten und unbehandelten Connexin32-Knockout (Cx32-KN)- und Connexin32-Wildtyp (Cx32-WT)-Mäusen untersucht. In vorausgegangenen Experimenten konnte gezeigt werden, dass Cx32 für den Prozess der Leberkrebsentstehung und ferner für die tumorpromovierende Wirkung des Modelltumorpromotors Phenobarbital (PB) in der Leber der beiden Stämme von entscheidender Bedeutung ist. So entwickeln Cx32-KN-Mäuse mehr hepatozelluläre Tumoren nach Gabe des Kanzerogens Diethylnitrosamin (DEN) als Cx32-WT-Mäuse. Im Gegensatz dazu kann die Entstehung von Lebertumoren in der Leber von Cx32-WT-Mäusen durch PB-Behandlung promoviert werden, nicht jedoch von Cx32-KN-Mäusen. PB-Behandlung verändert in normalen Hepatozyten die Expression zahlreicher Gene, wobei unklar ist, welche von diesen für die Tumorpromotion relevant sind. Ziel dieser Arbeit war es, mittels globaler Genexpressionsanalysen die unterschiedliche Empfindlichkeit von Cx32-KN- und Cx32-WT-Mäusen bezüglich der Entstehung von Lebertumoren und deren Beeinflussung durch PB aufzuklären. Es wurden dafür drei verschiedene Analysemethoden eingesetzt, wobei die Methode der Affymetrix-Microarray-Technologie die zuverlässigsten Ergebnisse brachte. Die statistische Auswertung der erhaltenen Daten ergab, dass sich die Genexpression in der Leber von unbehandelten Cx32-KN- und Cx32-WT-Mäusen nur geringfügig unterschied. Erstaunlicherweise konnte nur für 5 Gene, darunter Cx32, eine differentielle Expression verifiziert werden. Unter PB-Behandlung zeigten sich dagegen 59 Gene verändert. Hierbei war auffällig, dass die meisten von diesen in Cx32-KN- und Cx32-WT-Mäusen in gleicher Weise induziert bzw. reprimiert waren. Eine unterschiedliche Beeinflussung der Genexpression durch PB in den beiden Stämmen wurde bei 12 Genen nachgewiesen. Insgesamt wurden einige interessante Gene, die für die Tumorpromotion relevant sein könnten, als differentiell exprimiert identifiziert. Darunter das Gen, das für das Insulin-like growth factor binding protein 1 (Igfbp1) kodiert und bei der Wachstumsregulation von Bedeutung ist. In einer zweiten Studie wurde die Genexpression in Lebertumorgewebe untersucht. Dabei handelte es sich um Tumoren aus Cx32-WT-Mäusen, die entweder Ha-ras- oder beta-Catenin-mutiert waren. Vorausgegangene Untersuchungen zeigten, dass in der Leber DEN-behandelter Cx32-WT-Mäuse häufig Ha-ras-mutierte Tumoren entstehen, während sich in Mäusen, die zusätzlich PB-behandelt wurden, in der Regel beta-Catenin-mutierte Tumoren entwickeln. Die statistische Auswertung der bei der globalen Expressionsanalyse erhaltenen Daten zeigte große Unterschiede zwischen Tumor- und Normalgewebe, wobei sich Ha-ras- und beta-Catenin-mutierte Tumoren in ihren Expressionsprofilen deutlich voneinander unterschieden. So waren in Ha-ras-mutierten Tumoren 204 Gene (135 Gene induziert, 69 Gene reprimiert) und in beta-Catenin-mutierten Tumoren 163 Gene (102 Gene induziert und 61 Gene reprimiert) gegenüber dem Normalgewebe differentiell exprimiert. Interessanterweise waren nur 30 Gene in beiden Tumorarten gemeinsam verändert. Bei der Analyse der Funktion der veränderten Gene zeigte sich, dass für die Überlebensstrategie der beiden Tumorarten unterschiedliche Signal- und Stoffwechselwege von Bedeutung zu sein scheinen. So ergaben sich Hinweise auf starke Veränderungen im Aminosäurestoffwechsel in beta-Catenin-mutierten Tumoren, während in Ha-ras-mutierten Tumoren der Fettsäurestoffwechsel gestört zu sein scheint. Interessanterweise fanden sich auch unter den in beta-Catenin-mutierten Tumoren induzierten Genen einige, deren Proteine inhibitorisch im Wnt/Wingless-Signalweg aktiv sind. In Ha-ras-mutierten Tumoren waren dagegen einige Gene verändert, die für kleine GTPasen kodieren sowie Gene, deren Proteine bei der Regulation dieser kleinen GTPasen von Bedeutung sind. Darüber hinaus war in Ha-ras-mutierten Tumoren das Gen für den CAR-Rezeptor, der im Lebernormalgewebe als Transkriptionsfaktor PB-responsive Gene reguliert, stark vermindert exprimiert. Dies könnte unter Umständen eine Erklärung für die fehlende Promotionswirkung von PB auf Ha-ras-mutierte Tumoren liefern.

In this thesis gene expression were analyzed in the liver of phenobarbital (PB)-treated and untreated connexin32 (Cx32)-null and Cx32-wild-type mice. It could be demonstrated previously that Cx32 is an important factor for the formation of liver tumors and also for tumor promotion by the liver tumor promotor PB. N-nitrosodiethylamine (DEN)-initiated hepatocarcinogenesis is strongly enhanced in mice deficient in Cx32 in comparison with their wild-type counterparts. By contrast treatment of DEN-initiated Cx32-wild-type mice with PB results in tumor promotion, whereas this effect is lacking in Cx32-null mice. In normal hepatocytes PB mediates transcriptional activation of various genes but it's not clear yet which of these are relevant for tumor promotion. Main objective of this dissertation was to investigate the different susceptibility to hepatocarcinogenesis of PB-treated and untreated Cx32-null and Cx32-wild-type mice by analyzing global gene expression. Three different methods were used for screening liver tissues of both strains, of which the Affymetrix microarray technology was the most reliable procedure. Microarray hybridization followed by statistical analysis of data showed only a slight effect on gene expression provoked by the Cx32 gene-knock-out. Difference in expression could only be verified for 5 genes, including Cx32. By contrast, treatment with PB affected the expression of 59 genes, of which the majority were in the same range in both strains. 12 genes were differently affected by PB-treatment in Cx32-wild-type as compared to Cx32-null mice. In conclusion, some interesting genes could be identified differently expressed in the liver of both strains, possibly with relevance for tumor promotion. One gene among them codes for Insulin like growth factor binding protein 1 which is important for regulation of cell growth. A second microarray analysis investigated the global gene expression in liver tumor tissues which harbor activating mutations in either beta-catenin or Ha-ras. Liver tumors induced in the mouse by DEN frequently show activating mutations in the Ha-ras proto-oncogene. By contrast, DEN treatment combined with subsequent chronic administration of PB leads to activating mutations in the beta-catenin proto-oncogene. The microarray hybridization followed by statistical analysis of data showed that many genes were altered in expression, to very variable degrees, in tumors of both types. The distribution of altered genes differed between Ha-ras and beta-catenin mutated tumors. Compared to normal tissue 204 genes were differently expressed in Ha-ras mutated tumors and 163 genes in beta-catenin mutated tumors. Interestingly, only 30 genes showed an unidirectional alteration in both tumor types. By analyzing the function of all differently expressed genes it became obvious that different signalling and metabolic pathways may be important for the survival strategies of the two tumor types. These involve changes in the aminoacid metabolism in beta-catenin mutated tumors as opposed to alterations in lipid and cholesterol metabolism in Ha-ras mutated tumors. Moreover several genes induced in beta-catenin mutated tumors code for inhibitory proteins within the wnt-signalling pathway, whereas in Ha-ras mutated tumors some genes which code for small GTPases or proteins regulating monomeric G-protein signalling were upregulated. Additionally, one very interesting gene which was repressed in Ha-ras mutated tumors codes for the CAR-receptor. In normal liver tissue this receptor regulates the transcription of PB-responsive genes. The downregulation of the CAR-receptor may be one explanation for the lack of promotional activity of PB in Ha-ras mutated tumors.