Die Bindung eines neuen Dihydropyridins, A-312110, an rekombinante Sulfonylharnstoffrezeptoren : Vergleich mit dem Cyanoguanidin P1075

Abstract

Der ATP-empfindliche Kaliumkanal (KATP-Kanal) ist v.a. bekannt als Ansatzpunkt der Sulfonylharnstoffe (und Glinide), die durch Hemmung der Aktivität des Kanals in der β-Zelle des Pankreas die Insulinsekretion fördern. KATP-Kanäle kommen in allen erregbaren Zellen vor und sind Oktamere aus vier einwärtsgleichrichtenden Kaliumkanaluntereinheiten der Familie Kir6.x und vier Sulfonylharnstoffrezeptoren, SUR. Die Kir6.x Familie hat zwei Mitglieder, Kir6.1 (Gefäßmuskelzelle) und Kir6.2 (alle anderen Myozyten, B-Zellen usw.); von den SUR Subtypen gibt es SUR1 (B-Zelle, Gehirn), SUR2A (Herz- und Skelettmuskel) und SUR2B (glatte Muskelzellen). SUR2A und 2B entstehen durch alternatives Spleißen desselben Gens und unterscheiden sich nur in den letzten 42 Aminosäuren des Carboxyterminus. Öffner des KATP-Kanals werden für verschiedene therapeutische Anwendungen entwickelt, in neuerer Zeit v.a. zur Senkung der Hyperreaktivität der Bronchien bei Asthmatikern und der Blase und der abführenden Harnwege bei Harninkontinenz. Die Öffner sind strukturell außerordentlich heterogen. Dabei ist neuen Öffnern vom Dihydropyridintyp eine gewisse (in vivo) Selektivität für die Muskulatur der Harnwege (Kir6.2/6.1 + SUR2B) zugeschrieben worden; diese Dihydropyridine haben keine Affinität mehr zu spannungsabhängigen Kalziumkanälen. In dieser Arbeit haben wir die Bindung eines neuen KATP-Kanalöffners vom Dihydropyridintyp, A-312110, an die verschiedenen SUR-Subtypen gemessen, da die Erfassung der Bindungseigenschaften eines Dihydropyridins im rekombinanten System noch nicht vorgenommen wurde. Dazu wurden Kompetitionsexperimente mit den Radioliganden 3H-P1075 (tritiierter Öffner) und 3H-Glibenclamid in Membranen von HEK-Zellen durchgeführt, in denen der entsprechende SUR-Subtyp exprimiert war. Besonderes Gewicht wurde auf die Erfassung der allosterischen Kopplungen der A-312110 Bindung an die Bindung von Glibenclamid und MgATP gelegt sowie auf die Modulation dieser Effekte durch Koexpression von SUR mit Kir6.2. In Gegenwart von MgATP erwies sich A-312110 als potenter Ligand mit einer minimalen Selektivität für SUR2A (Ki = 14 nM gegen 3H-P1075 als Radioligand) über SUR2B (18 nM); dabei war die Bindung von A-312110 an SUR2A signifikant stärker an die Bindung von MgATP gekoppelt als die an SUR2B. Die Hemmkurven der 3H-Glibenclamid Bindung an SUR2A und 2B durch den Öffner wurden an Punktmutanten der SURs mit erhöhter Glibenclamidaffinität gemessen. Die Hemmkurven waren deutlich biphasisch mit einer charakteristischen Aufteilung der beiden Komponenten, wie wir sie zuvor auch bei anderen "typischen" Öffnern beobachtet haben (Russ et al., Br J Pharmacol, 139:368-380 (2003)). Damit gehört auch A-312110 in die Kategorie der "typischen Öffner". In der Abwesenheit von MgATP war die Bindung des Öffners an SUR2A um einen Faktor 140, and SUR2B um 70 geschwächt. Der Faktor 70 am SUR2B ist dabei deutlich schwächer als für die meisten anderen Öffner, bei denen er im Mittel 200 beträgt (Russ et al., op. cit.). In Gegenwart von MgATP schwächte Koexpression mit Kir6.2 die Affinität von SUR2A für A-312110 um einen Faktor ~2 und erhöhte die für Glibenclamid um einen Faktor 5; zudem wurde durch die Koexpression die Biphasizität der 3H-Glibenclamid - A-312110-Hemmkurve an (mutierten) SUR2A herabgesetzt. Die Wechselwirkung mit SUR1 war vernachlässigbar (Ki > 300 nM).

Zusammenfassend läßt sich sagen, daß das Bindungsprofil von A-312110 zwar in einigen charakteristischen Details von P1075 abweicht (z.B. in der bevorzugten Kopplung an SUR2A), im Großen und Ganzen aber doch dem von P1075 ähnelt. In Anbetracht der strukturellen Verschiedenheit der beiden Öffner ((Dihydropyridin vs. Cyanoguanidin/Pyridin) ist diese Übereinstimmung erstaunlich und läßt vermuten, daß beiden Öffnern ein gemeinsames Pharmakophor zur Kopplung an den SUR zugrunde liegt. Eine in vitro Selektivität für die glatte Muskulatur der Harnbase läßt sich nicht feststellen.

The ATP- dependant potassium channel (KATP-channel) is best known as the target of the sulfonylureas (and glinides), which enhance insulin-secretion via inhibition of the activity of the channel in the pancreatic beta-cell. KATP-channels are present in all excitable cells. They are octamers composed of four inwardly rectifying K+-channel-subunits from the Kir6.x family and of four sulfonylurea-receptors, SUR. The Kir 6.x family has two members, Kir6.1 (vascular smooth muscle) and Kir6.2 (all other types of muscular cells, beta-cells etc.). The SUR family consists of SUR1 (pancreatic beta-cells, neurons) SUR2A (cardiac and skeletal myocytes) and SUR2B (smooth muscle myocytes). SUR2A and SUR2B are generated by alternative splicing of the same gene and differ only in the last 42 amino acids of the carboxy-terminus. Openers of the KATP-channel have therapeutic potential useful in different areas, particularly in asthma (by inhibiting airway hyperreactivity) and in bladder overactivity. The openers are structurally heterogeneous. New openers of the dihydropyridine-type show a certain in vivo selectivity for the smooth muscle in the urinary tract (Kir6.2/6.1 + SUR2B). These new dihydropyridines have almost no affinity for L-type Ca2+ channels. In this work, we have examined the binding of the novel dihydropyridine KATP-channel opener, A-312110, to the sulponylura-receptor subtypes, because the binding characteristics of dihydropyridines have not yet been established in the recombinant system. For that purpose we performed radioligand competition experiments using 3H-P1075 (tritiated opener) and 3H-glibenclamide as the radioligands in membranes of HEK-cells expressing the different SUR-subtypes. Emphasis was placed on the study of the allosteric coupling of A-312110 binding with the binding of glibenclamide and MgATP, and on the modulation of these effects by coexpression of SUR with Kir6.2. In the presence of MgATP, A-312110 was a potent ligand with a slight selectivity for SUR2A (Ki= 14 nM against 3H-P1075 as radioligand) over SUR2B (18 nM). At SUR2A, binding of A-312110 was coupled significantly more strongly to MgATP binding than in case of SUR2B. Inhibition of 3H-glibenclamide binding to SUR2A and 2B by the opener was studied using the mutants SUR2A(Y1206S) and SUR2B(Y1206S) which have an increased affinity for glibenclamide. The inhibition curves were clearly biphasic with characteristics that we had observed earlier with other �typical openers� (Russ et al., Br J Pharmacol, 139:368-380 (2003)). For this reason, A-312110 belongs to the class of �typical openers�. In the absence of MgATP, binding of the opener to SUR2A was decreased ~140 fold, to SUR2B ~70 fold. The factor ~70 of SUR2B is clearly lower than for most of the other openers (average value ~200, Russ et al., op. cit.). In the presence of MgATP, coexpression with Kir6.2 weakened the affinity of SUR2A towards A-312110 by the factor ~2 and increased the affinity of SUR2A to glibenclamide by the factor ~5. Furthermore, the biphasic nature of the 3H-glibenclamide � A-312110 inhibition curve with SUR2A(Y1206S) was diminished by coexpression with Kir6.2. Interactions with SUR1 were negligible (Ki > 300 nM).

In summary, one can state that the binding-profile of A-312110 differs from that of P1075 in some characteristic details (e.g. the preferential coupling with SUR2A) but on the whole, the binding characteristics of the two openers they are very similar. In consideration of the structural differences between the two (dihydropyridine vs. cyanoguanidine/pyridine) this similarity is astonishing. One may assume that both openers share a common pharmacophore to couple to SUR. No in vitro selectivity for the smooth muscle of the urinary tract over other muscle cells was found.