Inhaltszusammenfassung:
Die DEG/ENaC (Degenerine/epitheliale Natrium Kanäle) Gen-Familie ist eine Klasse Natrium-selektiver Ionenkanäle, deren Vertreter in fast allen tierischen Vielzellern (Metazoa) vorkommen. Die einzelnen Untergruppen sind funktionell sehr unterschiedlich, es ist jedoch nichts über den Ursprung und die ursprünglichen Eigenschaften der Kanäle bekannt. Im Gegensatz zu K+-, Cl-- oder Wasserkanälen kommen DEG/ENaC Ionenkanäle weder in einzelligen Lebewesen noch in Pflanzen vor. Da Cnidarier die primitivsten Metazoen sind, die ein Nervensystem besitzen, haben wir die cDNA von 4 DEG/ENaC Untereinheiten aus dem Modell-Cnidarier Hydra magnipapillata isoliert: HyNaC1-4.
Diese Arbeit hatte zwei Ziele: zum einen die phylogenetische Einordnung der neu klonierten Hydra Proteine in die Familie der DEG/ENaC Kanäle und zum zweiten die Charakterisierung des Aktivierungsmechanismus und der elektrophysiologischen Eigenschaften der Hydra Ionenkanäle.
Die phylogenetische Analyse zeigte, daß ASICs und BLINaCs/INaC nahe Verwandte von HyNaCs sind, wohingegen ENaCs und die FMRFamid-aktivierten FaNaCs entfernter stehen. ASICs sind Protonen-aktivierte Ionenkanäle, die hauptsächlich im Nervensystem von Säugern exprimiert werden. BLINaCs sind eine Untergruppe der DEG/ENaC Superfamilie mit unbekanntem Liganden; sie werden im Gehirn, der Leber und dem Verdauungstrakt von Mäusen und Ratten exprimiert, während INaC, das Ortholog im Menschen, nur im Darm gefunden wird.
Durch Applikation der Hydra-Neuropeptide HydraRFamid I und II konnten wir in Frosch-Oozyten, die HyNaC2 und 3 exprimierten, große Ströme hervorrufen. Die Aktivierung war dosisabhängig, wobei beide Peptide in etwa die gleiche Affinität besaßen (EC50 ~ 25 µM). HyNaC2/3 Kanäle waren unselektiv gegenüber monovalenten Kationen und wurden durch Amilorid mit einer geringen Affinität blockiert (IC50 ~ 500 µM). Die Inhibierung von G-Proteinen und die Veränderung der Expressionsstärke von Hemi Gap Junctions führten zu keiner Veränderung der Stromamplituden, was auf eine direkte Kanalaktivierung schließen lässt.
Durch in-situ-Hybridisierungen konnten wir zeigen, daß in der Hypostom-Region, direkt an den Basen der Tentakel, Zellen, die HyNaCs exprimieren, neben Neuronen liegen, die HydraRFamide exprimieren. Dies lässt vermuten, daß die Peptide die natürlichen Liganden der HyNaC Kanäle sind. Desweiteren scheint die Interaktion mit Peptiden ein allgemeines Merkmal der DEG/ENaC Kanäle zu sein, da wir zeigen konnten, daß Protonen-aktivierte ASIC-Ströme ebenfalls durch HydraRFamide moduliert werden.
Unsere Ergebnisse zeigen, daß das einfache Nervensystem von Hydra Neuropeptide zur schnellen Signalübertragung benutzt, was darauf schliessen lässt, daß Peptide eine der ersten Liganden für Ionenkanäle in Metazoen überhaupt waren. Desweiteren eröffnet die enge Verwandtschaft von HyNaCs zu INaC und ASIC4, deren beider Aktivierungsstimulus noch nicht gefunden wurde, die Möglichkeit, daß die Liganden dieser beiden Kanäle unter den RFamid-artigen Peptiden zu suchen sind.
Abstract:
The degenerin (DEG)/epithelial sodium channel (ENaC) gene family represents a class of sodium selective ion channels found in nearly all multicellular animals (Metazoa). The members of this ion channel family are functionally diverse, however, nothing is known about the evolutionary origin and the primitive characteristics. In contrast to K+, Cl- or water channels, DEG/ENaC ion channels are neither present in unicellular organisms nor in plants. Since cnidarians are the simplest metazoans having a nervous system, we used the model cnidarian Hydra magnipapillata to isolate cDNA for four different DEG/ENaC subunits, HyNaC1-4. The present work had two purposes: first the phylogenetic classification of the newly cloned Hydra proteins within the diverse family of DEG/ENaC channels and second the characterization of the activation mechanism and of the electrophysiological properties of HyNaC ion channels.
The phylogenetic analysis showed that HyNaCs are close relatives of vertebrate ASICs and BLINaCs/INaC, whereas ENaCs and the FMRFamide-gated FaNaCs are more distant relatives of HyNaCs. ASICs are proton-gated ion channels mainly expressed in the mammalian nervous system. BLINaCs are a subgroup of the DEG/ENaC superfamily with an unknown ligand, expressed in the brain, liver and intestine of mouse and rat and INaC is the human orthologue found exclusively in the intestine.
We could evoke robust currents in oocytes expressing HyNaC2 and 3 by application of HydraRFamides I or II, which are common neuropeptides in Hydra. The activation was dose-dependent with similar potency for both peptides (EC50 ~ 25 µM). HyNaC2/3 was unselective for monovalent cations and was blocked by amiloride with a rather low affinity (IC50 ~ 500 µM). Inhibiton of G-proteins as well as altering expression of hemi gap junctions did not change current amplitudes, suggesting direct channel activation.
Using in situ hybridization, we located the HyNaC expressing cells adjacent to the HydraRFamide expressing neurons in the hypostome region at the bases of the tentacles, suggesting that the peptides are the natural ligands for this channel. Moreover, peptide interaction seems to be an common feature of DEG/ENaC channels since we could show that HydraRFamides can also modulate proton-activated ASIC currents.
Our results show that the simple nervous systems of Hydra uses neuropeptides for fast neurotransmission, suggesting that neuropeptides were among the first ligands for ion channels. Furthermore, close relationship of HyNaCs to both human INaC and ASIC4, for which the activating stimulus is not yet known, opens the possibility that ligands for these two channels are among RFamide-like peptides.
ion channels , Hydra magnipapillata , elektrophysiology , phylogeny , neuropeptides