Genetische Ablation von Pde6h und Kcnv2 in der Maus zur Generierung neuer Modellsysteme für hereditäre Netzhauterkrankungen

Abstract

Die vorliegende Arbeit beschreibt die genetische Ablation von Pde6h und Kcnv2 in der Maus mit dem Ziel der Generierung der Pde6h-knockout- sowie der Kcnv2-knockout-lacZ-knockin-Mauslinie als neue Tiermodelle für erbliche Netzhauterkrankungen. Das Pde6h-Gen codiert für die inhibitorische gamma’-Untereinheit der Zapfen-Phosphodiesterase, welche in der Phototransduktion an der Umwandlung von Licht in neuronale Signale beteiligt ist. Die Aktivierung der PDE erfolgt nach Lichteinfall über Transducin, welches im aktivierten Zustand an die inhibitorische Untereinheit der PDE bindet, diese vom katalytischen Kern abdissoziiert und somit die katalytische Aktivität der PDE in Gang setzt. Die Hydrolyse von cGMP resultiert in einem Schließen von CNG-Kanälen, was eine verminderte Glutamatfreisetzung an der Photorezeptorsynapse zur Folge hat. Bislang ist noch sehr wenig über das Pde6h-Gen bekannt, das auch als potentielles Krankheitsgen für erbliche Netzhauterkrankungen diskutiert wird. Zur Erforschung der genauen Funktion von Pde6h und der biochemischen Funktionsparameter der Zapfen-Phototransduktion, sowie der Expression und Funktion von Pde6h auch in nichtretinalen Geweben, sollte in der vorliegenden Arbeit das Pde6h-Gen konstitutiv und auch konditional deletiert werden. Durch Vergleich der Phänotypen der knockout-Mäuse mit wildtyp-Kontrollen können dann Rückschlüsse auf die biologische Funktion von Pde6h gezogen werden. Basierend auf dem Cre/loxP-System wurde eine Strategie entwickelt, mit der die Generierung sowohl des konstitutiven als auch des konditionalen Pde6h-knockouts erreicht werden kann. Anhand der Genstruktur wurden die proteincodierenden Exone 2-4 ausgewählt, um sie mittels homologer Rekombination in embryonalen Stammzellen der Maus mit zwei loxP-Sequenzen zu flankieren. In zahlreichen Klonierungsschritten wurde ein geeignetes DNS-Konstrukt hergestellt und dieses in Stammzellen von Mäusen eingebracht. Das Konstrukt integrierte an entsprechender Stelle ins Stammzellgenom, und die gewünschten Klone mit homologer Rekombination wurden durch Verwendung von Selektionsmedium und Southern Blot-Analyse identifiziert. Nach Blastozysteninjektion der Klone mit anschließendem Embryotransfer in pseudoschwangere Ammen wurden mehrere hochchimäre Mäuse geboren. Die Chimärenverpaarung resultierte in zwei Nachkommen mit nachgewiesener Keimbahngängigkeit der Mutation, und durch Einkreuzen von CMV-„Cre-Deleter“-Mäusen mit anschließendem Auskreuzen des Cre-Transgens wurde die Pde6h-knockout-Linie etabliert. Immunfluoreszenz-Analysen mit einem spezifisch gegen die gamma’-Untereinheit der Zapfen-PDE gerichteten Antikörper an Pde6h-/- Retinaschnitten bestätigten die Deletion von Pde6h. Pde6h-/- Mäuse sind lebensfähig und stehen nun zur Untersuchung von verhaltensbiologischen und physiologischen Störungen zur Verfügung. Erste Analysen der Netzhautfunktion mittels ERG, SLO und OCT zeigten bislang keinen Unterschied zwischen Pde6h-/- Tieren und wildtyp-Kontrollen, was eventuell auf kompensatorische Effekte zurückzuführen sein könnte. Eine potentielle Möglichkeit hierfür wäre beispielsweise eine kompensatorische Expression von Pde6g in Pde6h-/- Zapfen. Weitere Untersuchungen an Mäusen mit einem Pde6g/Pde6h-Doppelknockout oder auch die Generierung von Pde6h-/-/Nrl-/- Mäusen mit einer „zapfendominierten“ Netzhaut könnten zur Aufklärung dieser kompensatorischen Mechanismen beitragen. Durch Verpaarung von Mäusen mit von zwei loxP-Sequenzen flankierten Exonen mit entsprechenden Cre-exprimierenden Mäusen kann das Pde6h-Gen auch gewebespezifisch oder induzierbar deletiert werden. Dies bietet weitere Möglichkeiten zur Aufklärung der physiologischen und pathophysiologischen Funktionen von Pde6h. Vom Kcnv2-Gen wird vermutet, dass es für eine modulatorische Untereinheit des spannungsgesteuerten K+-Kanals in den Innensegmenten der Photorezeptoren codiert, welcher an der Modulation von lichtinduzierten Signalen beteiligt ist. Mutationen in KCNV2 beim Menschen verursachen eine bestimmte Form der Netzhautdystrophie. Im Rahmen dieser Arbeit wurde ein Kcnv2-knockout-lacZ-knockin-Konstrukt, welches ebenfalls auf dem Cre/loxP-System basiert und das lacZ-Gen unter dem nativen Kcnv2-Promotor exprimiert, mittels homologer Rekombination in embryonale Stammzellen von Mäusen eingebracht und die Selektionskassette durch Cre-Rekombination entfernt. Klone mit homologer Rekombination sowie Deletion der Selektionskassette wurden mittels Southern Blot-Analyse und PCR identifiziert und zur Blastozysteninjektion vorbereitet. Zukünftig können somit chimäre Tiere generiert werden, und nach weiterer Verpaarung mit wildtyp-Mäusen wird getestet, ob eine Keimbahntransmission vorliegt. Nach Etablierung der entsprechenden Mauslinie sollen anschließend physiologische und pathophysiologische Parameter studiert und indirekt über die Expression von lacZ auch die Expression von Kcnv2 in nichtretinalen Geweben analysiert werden.

The present study describes the genetic ablation of Pde6h and Kcnv2 in mice by methods of molecular biology with a view to generate a Pde6h-knockout and a Kcnv2-knockout-lacZ-knockin mouse line representing new animal models for hereditary retinal diseases. The Pde6h gene encodes the inhibitory gamma’-subunit of the cone phosphodiesterase, which is involved in the transformation of light into neuronal signals in phototransduction. When light strikes the photoreceptors, PDE is activated by the active form of transducin, which binds to the inhibitory subunit of cone PDE and sterically displaces the latter, thereby relieving its inhibitory effect on the catalytic subunits and permitting the hydrolysis of cGMP. This signaling results in closure of CNG-channels, followed by hyperpolarization of the cell membrane and a decrease in glutamate release at the cell synapse. There is still little known about Pde6h, but in the last years it was discussed as a potential disease-causing gene for hereditary retinal diseases. To investigate the function of Pde6h and the biochemical parameters of cone phototransduction in further detail as well as the expression and function of Pde6h in nonretinal tissues, the aim of the present study was to delete Pde6h in a constitutive and a conditional manner in mice. Subsequent comparison of the resulting phenotype of knockout mice with their wildtype littermates will reveal the biological function of Pde6h. The developed knockout strategy was based on the Cre/loxP system, enabling to generate a constitutive as well as a conditional knockout of Pde6h. The gene architecture was analyzed, choosing the exons 2-4 to be flanked by two loxP sites by homologous recombination in embryonic stem cells of mice. In numerous cloning steps, a suitable DNA construct was generated and finally electroporated into murine stem cells. The targeting construct was integrated into the stem cell genome, and the desired homologous recombinant stem cell clones were identified using selective medium and Southern blot analysis. After blastocyst injection of these clones and subsequent embryo transfer into pseudo-pregnant foster mice, several highly chimeric mice were born. Mating of chimeras yielded two progenies with proven germ-line transmission of the mutation. Crossing to transgenic CMV-“Cre-deleter”-mice and subsequent outcrossing of the transgene finally resulted in Pde6h knockout mice. Immunofluorescence analysis of retinal Pde6h-/- slices with an antibody specifically directed against the gamma-subunit of cone PDE confirmed the deletion of Pde6h. Pde6h-/- mice are viable and are now available for investigations of behavioural and physiological disorders. First functional analysis of the retina by ERG, SLO and OCT revealed no difference between Pde6h-/- mice and wildtype littermates, possibly indicating compensatory mechanisms. One possible explanation could be the expression of Pde6g not only in rods but also in Pde6h-/- cones. Further investigations for example with Pde6g/Pde6h double knockout mice or the generation of Pde6h-/-/Nrl-/- mice with a “cone-dominated” retina could help to reveal compensatory effects. By mating mice carrying exons flanked by two loxP sites with appropriate mice that express Cre recombinase, the Pde6h gene can also be deleted in a tissue specific or inducible manner. These methods provide further possibilities to investigate the physiological and pathophysiological role of Pde6h. Kcnv2 presumably encodes a modulatory subunit of a voltage gated K+-channel in the inner segments of photoreceptors, which is involved in the modulation of light induced signals. Mutations in KCNV2 in humans cause a particular form of retinal dystrophy. In the present study, a Kcnv2-knockout-lacZ-knockin targeting construct, based on the Cre/loxP-system and expressing lacZ under the control of the native Kcnv2 promotor, was introduced into embryonic stem cells of mice by homologous recombination. Using Cre recombinase, the selection cassette was deleted, and stem cell clones with homologous recombination as well as deletion of the selection cassette were identified by Southern blot analysis and PCR. Several selected clones were prepared for blastocyst injection, which in future will lead to the generation of chimeric mice. By mating with wildtype mice, the occurrence of germ-line transmission will be analysed. After the establishment of the desired mouse line, physiological and pathophysiological parameters will be investigated and the expression of Kcnv2 will be observed indirectly by analysing the expression of lacZ in nonretinal tissues.