Cell division is an essential process which was prerequisite for the development of life and is key for both development of complex organisms and reproduction in general. The accuracy of this process, which is a part of mitosis, depends on the mitotic spindle, a bipolar, dynamic structure which segregates sister chromatids and thus separates the genomes of the two developing daughter cells. Its shape is defined by the arrangement of polar filaments called microtubules. Mitotic defects can result in cell death but also, if missed by cellular control systems, in the development of cancer. The tetrameric motor protein Eg5 is believed to separate spindle poles by cross-linking and pushing apart microtubules emanating from opposite poles and overlapping at the spindle midzone. Depletion or inhibition of Eg5 causes the formation of star-shaped, morphologically monopolar spindles. The function of the mitotic spindle has received a lot of attention in cell biology for the last 100 years leading to a very detailed characterization of the role of its individual substructures or proteins in spindle formation. During the last two decades, the advent of novel technologies like RNA interference, high-throughput sequencing and microscopy resulted in significant growth of our knowledge about this process. Although existing ideas about how individual elements might cooperate and the development of an integrated concept of bipolar spindle formation are evolving rapidly, we still struggle to keep pace with the experimental results made possible by technological progress. In this work, we aimed to better understand the interplay of Eg5 with its synergists and antagonists during spindle formation by searching for perturbations allowing bipolar spindles to form in absence of Eg5 activity.

During preliminary studies for the project, we find that the most frequent approach to quantify the fraction of defective spindles forming after experimental perturbations, counting of their frequency in fixed immunofluorescence microscopy samples, results in fundamentally wrong conclusions. They are caused by the spindle assembly checkpoint, which arrests malformed spindles in mitosis until their defects can be repaired, and thus leads to their preferential accumulation in mitosis. We prove both the resulting distortion in fixed samples as well as the potentially false results using both mathematical modeling and proof-of-concept experiments.

Therefore focusing on a rigorous live-cell-imaging approach, we identify a new pathway of bipolar spindle formation which does not depend on Eg5 motor activity. Upon slight perturbations of microtubule dynamics using either low doses of the microtubule drug nocodazole or depleting the protein TOGp, functional bipolar spindles assemble despite inhibition of Eg5. This process is accompanied by an increase in microtubule nucleation in the vicinity of chromatin. This is the first time that chromosomal nucleation is directly linked to centrosome separation. Moreover, we show that this is a fully redundant, self-sufficient and Eg5-independent pathway which suggests that current bipolarization models, collectively relying on Eg5 as a pivotal force behind pole separation, will have to be adjusted.

Furthermore, because most current models rely on fixed samples as the main source of experimental evidence, these results will have to be revalidated using live-cell imaging. Our results might also have implications for the ongoing development of chemotherapeutic treatment regimens involving Eg5 inhibitors which are currently under evaluation for cancer treatment because of their antiproliferative effect. Because microtubule drugs (similar to nocodazole) are also used in such protocols, combination therapies involving both may be less effective than predicted.

Die Zellteilung ist ein essentieller Prozess, der für die Entstehung von Leben notwendig war und sowohl für die Vermehrung als auch die Entwicklung komplexer Organismen zentral ist. Der korrekte Ablauf dieses Prozesses, der Teil der Mitose ist, bedarf einer intakten mitotischen Spindel, einer bipolaren dynamischen Struktur welche Schwesterchromatiden trennt und so das Genom an die zwei entstehenden Tochterzellen weitergibt. Die Form der Spindel wird durch die Anordnung von Mikrotubuli, polaren Filamenten aus denen sie zum größten Teil besteht, bestimmt. Mitotische Defekte können apoptotischen Zelltod, aber auch, wenn die zellulären Kontrollmechanismen versagen, die Entstehung von Krebs zur Folge haben. Man nimmt an, daß das Tetramere bildende Motorprotein Eg5 zur Trennung der Spindelpole beiträgt, indem es an den Polen entspringende und einander am Spindeläquator überlappende Mikrotubuli quervernetzt und auseinanderdrückt. Die Inhibition oder Depletion dieses Proteins führt in fast allen Eukaryoten zur Bildung von sternförmigen, monopolaren Spindelstrukturen. Die Funktionsweise der mitotischen Spindel hat während der letzten Hundert Jahre sehr viel Aufmerksamkeit erfahren, weshalb die individuelle Rolle vieler ihrer Bausteine sehr detailliert charakterisiert ist. Neue Technologien wie RNA Interferenz, Hochdurchsatzsequenzierung und -mikroskopie haben unser Wissen über diesen Vorgang signifikant erweitert. Obwohl es Konzepte gibt, wie die individuellen Elemente der Spindel im gegenseitigen Wechselspiel zur Spindelbildung führen könnten, konnte ihre Weiterentwicklung nicht mit dem rasanten Wachstum an experimentellen Ergebnissen Schritt halten. In dieser Arbeit haben wir versucht, die Wechselwirkungen zwischen Eg5, seinen Synergisten und Antagonisten während der Spindelentstehung besser zu charakterisieren, indem wir nach zellulären Veränderungen gesucht haben, die die Bildung von bipolaren Spindeln in Abwesenheit von Eg5-Aktivität ermöglichen.
In der Planungsphase dieses Projekts bemerkten wir, daß die am häufigsten angewendete Methode, den Anteil an fehlerhaften Spindeln nach experimentellen Manipulationen zu bestimmen, nämlich deren Zählung nach Fixierung und Immunfluoreszenzfärbung, fundamental fehlerhafte Ergebnisse liefert. Dies wird indirekt durch den Spindelkontrollpunkt ("spindle assembly checkpoint") verursacht, der Zellen mit fehlerhaften Spindeln daran hindert, die Mitose zu beenden und selektiv zu deren Anreicherung in der mitotischen Population führt. Wir beweisen durch ein mathematisches Modell, dessen Voraussagen wir durch Beispielexperimente beweisen können, dass diese Verzerrung zu falschen experimentellen Ergebnissen führt. Deshalb wurden alle quantitativen Ergebnisse des nachfolgenden Projekts mit Hilfe von Echtzeitaufnahmen von lebenden Zellen generiert.
Das Hauptergebnis dieser Arbeit ist die Entdeckung, daß mitotische Zellen nach leichter Stabilisierung von Mikrotubuli durch niedrige Dosen des Mikrotubuligiftes Nocodazol oder Depletion des Proteins TOGp bipolare Spindeln bilden, obwohl Eg5 inhibiert wird. Dieser Vorgang geht mit einer Verstärkung der Mikrotubulinukleation in der Nähe von Chromatin einher. Dies ist das erste Mal, das eine direkte Verbindung zwischen chromosomaler Mikrotubulinukleation und Polseparation gezeigt wird. Darüber hinaus zeigen wir, dass es sich um einen alternativen, redundanten und Eg5-unabhängigen Mechanismus der Spindelbildung handelt. Da bestehende Modelle für diesen Vorgang generell auf Eg5 als einen grundlegenden Erzeuger von nach außen gerichteten Kräften aufbauen, werden sie um den von uns gefundenen Mechanismus ergänzt werden müssen. Da frühere Modelle zudem zum größten Teil auf mit fixierten Proben gewonnenen Ergebnissen basieren, müssen sie außerdem revalidiert werden.
Schließlich könnten unsere Ergebnisse sich auch auf die laufende Entwicklung von Chemotherapieprotokollen, in denen Eg5-Inhibitoren aufgrund ihrer antiproliferativen Wirkung verwendet werden, auswirken. Die Überlegung dahinter ist, daß sie antiproliferativ auf Krebszellen wirken. Weil nocodazolähnliche Mikrotubuligifte einen fixen Bestandteil von solchen Kombinationsprotokollen darstellen, könnte ihre gemeinsame Verwendung mit Eg5-Inhibitoren zu einer verminderten Wirksamkeit beider Medikamentklassen führen.