Influence of ribozyme cleavage in E. coli expression systems and the utilization of ligand-dependent ribozymes for conditional genetic control in C. elegans
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Modernste bioinformatische Analysen zeigten, dass das Hammerhead-Ribozym (HHR), das Twister-Ribozym und ähnliche kleine endonukleolytische Ribonukleinsäure (RNA)-Motive weit verbreitet und in allen Lebensbereichen vorzufinden sind. Dies verdeutlicht, dass Ribozyme in sehr wichtigen genetischen Prozessen verschiedener Organismen eine Rolle spielen. Obwohl das Hammerhead-Ribozym bereits seit drei Jahrzehnte untersucht wird, ist noch immer sehr wenig über den Einfluss aktiver Ribozyme auf die Genexpression bekannt. Darüber hinaus sind Ribozyme hervorragende Expressionsplattformen von RNA-Schaltern zur induzierbaren Kontrolle der Geneexpression. Die vorliegende Dissertation untersucht anhand des Hammerhead-Ribozymes die Einflüsse von Ribozymen auf die Genexpression in verschiedenen Organismen. Darüber hinaus wird die Entwicklung eines neuen Models präsentiert, in dem ribozymbasierte RNA-Schalter zur Kontrolle genetisch bedingter Prozesse im multizellulären Modelorganismus C. elegans angewandt werden können. Im ersten Teil der Arbeit wird die hohe Motiv- und Organismusabhängigkeit von Ribozymen im Einfluss auf die Geneexpression in verschiedenen Organismen präsentiert. Dafür wurde eine Auswahl von acht natürlich vorkommenden Hammerhead-Ribozymen in verschiedenen genetischen Hintergründen und Organismen eingebracht. Insbesondere der Einfluss von Ribozymen auf die bakterielle Genexpression wurde analysiert. Die daraus erhaltenen Ergebnisse wurden mit einer früheren, vorliegenden Studie in Hefe- und Humanzellen verglichen. Die eingebrachten Ribozyme lösten eine unerwartet hohe organismusspezifische Variabilität in der Genexpression aus. Folglich wird die Geneexpression erheblich durch das ribozymbasierte Spalten der RNA beeinflusst. Dieser Effekt variiert jedoch und ist stark vom jeweiligen genetischen Kontext abhängig. Die schnell-spaltenden Typ 3 Hammerhead-Ribozyme [CChMVd(-) and sLTSV(-)] zeigten tendenziell die stärksten Effekte auf die intrazelluläre Genexpression. Die präsentierten Ergebnisse sind wichtig im Hinblick auf potentielle Funktionen der natürlich vorkommenden Ribozyme in der Prozessierung von RNA und posttranskriptionalen Regulation der Geneexpression. Die erhaltenen Erkenntnisse haben Relevanz für weitere Anwendungen in der Biotechnologie und der synthetischen Biologie. In diesen Bereichen werden RNA-Schalter basierend auf selbstspaltenden Ribozymen entwickelt, um genetische Prozesse präzise zu kontrollieren. Im zweiten Teil der Thesis wurden liganden-abhängige Ribozyme (Aptazyme) im Modelorganismus Caenorhabditis elegans angewandt. Dabei wurde ein durch Aptazyme induzierbares, neurodegeneratives Krankheitsmodel entwickelt. Ribozyme sind als flexible Expressionsplattformen besonders gut für die Entwicklung verschiedener ligandenabhängiger Genregulatoren im genetischen Kontext von Bakterien, Hefen oder Humanzellen geeignet. Das Binden eines spezifischen Liganden im Aptamer, das mit der Ribozym-Expressionsplattform fusioniert ist ermöglicht das Schalten der Genexpression und das konzentrationsabhängige Spalten des Ribozyms. In eukaryotischen Systemen führt das durch Aptazyme induzierte Spalten der mRNA innerhalb einer untranslatierten Region zum Abbau der RNA und dadurch zur Herabregulation der Geneexpression. Für den Modelorganismus C. elegans sind bisher keine Methoden zum einfachen, induzierbaren Schalten der Genexpression bekannt. Hier wurden mehrere zur Verfügung stehende Aptazyme in C. elegans analysiert, um die Aptazym-Technologie in Richtung dieses wichtigen Modelorganismus zu erweitern. Ein genomischintegrierter, tetrazyklinabhängiger RNA-Schalter ermöglichte 2,5-faches Anschalten der Geneexpression in Abhängigkeit zum zugegebenen Effektor in C. elegans. Die verwendeten Tetrazyklinkonzentrationen sind nicht toxisch und schaltbare Geneexpression wurde über alle Entwicklungsstufen, vom Embryo bis zum jungadulten Wurm, bewiesen. Genexpression konnte auch in Tag 1-adulten Würmern induziert werden. Dies stellt neben der einfachen Einbringung des Expressionssystems einen weiteren Vorteil gegenüber anderen bisher bekannten Systemen zur Geneexpressionskontrolle in C. elegans dar. Der Schalter kann in Kombination mit wurmeigenen Promotoren die Geneexpression spezifisch in verschiedenen Geweben des Wurmes kontrollieren. Der Anschalter wurde zur Entwicklung eines neuen, neurodegenerativen Models in C. elegans verwendet. Neurodegenerative Trinukleotiderkrankungen werden durch mutierte Proteine mit abnormal langen Ausdehnungen von CAG-Triplets, Polyglutaminen (PolyQs) verursacht. Das hier entwickelte, induzierbare PolyQ-Model in C. elegans weist zwei innovative Besonderheiten im Vergleich zu anderen Modellen auf: es ist durch das eingebrachte Aptazym induzierbar und wird ubiquitär exprimiert. Dadurch ist es ein vielversprechendes, neues PolyQ-Model, beispielsweise für die Anwendung in Bezug auf Aggregatlokalisation, oder -transmission, für Studien von Interaktionspartnern innerhalb von Aggregaten oder deren Abbau während des Alterungsprozesses.
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WURMTHALER, Lena A., 2018. Influence of ribozyme cleavage in E. coli expression systems and the utilization of ligand-dependent ribozymes for conditional genetic control in C. elegans [Dissertation]. Konstanz: University of KonstanzBibTex
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