My thesis entitled ‘Characterization of cryptic components of the ancestral vertebrate genome’ aims at reconstructing the changes in DNA that parallel the evolution of vertebrates. The central question is which changes on the genomic level accompany, and maybe even account for, the emergence of phenotypic novelties. This approach is also key to a deeper understanding of the evolution of the human genome. Vertebrates are distinguished from invertebrates by numerous characteristics. Vertebrates are phenotypically characterized, for example, by a complex tripartite brain with integrative centers such as the telencephalon and an embryonic neural crest that contributes to elaborate craniofacial features that enable a predatory lifestyle. On the genomic level, vertebrates are distinguished from other chordates by two rounds of whole genome duplication (2R-WGD) that occurred in the last common ancestor of vertebrates around 525 million years ago. Initially, the ancestral vertebrate possessed four copies of each gene. Some of this redundant genetic material was subsequently deleted from the genome, or genes accumulated mutations and eventually became nonfunctional pseudogenes. A differential gene loss between vertebrate lineages might partly explain the phenotypic differences across vertebrates. My approach focuses on key developmental gene families (Bmp, Pax, Hox and ENC gene families) whose members are not present in all vertebrate lineages.

A subproject of this thesis focused on the famous Hox gene family that specifies positional identity along the primary body axis in the early embryo across metazoans. The Hox14 gene was hitherto identified only in a handful of basal vertebrates (shark, lamprey and coelacanth), and I revealed the existence of a Hox14 gene in the Australian lungfish. In addition, I showed that its expression in lungfish, similar to shark and lamprey, is decoupled from the typical ‘Hox-code’.

Another subproject involved the Pax6 gene that is considered to be the ‘master control gene’ for eye development throughout bilaterians. My research revealed that its sister gene Pax4, that was hitherto only identified in mammals, also exists in the genomes of teleosts, the coelacanth and some reptiles (turtles and crocodiles). Interestingly, I identified a previously unknown gene, Pax10, that is most likely the third gene of the original gene quartet, including Pax4 and -6, derived from the 2R-WGD. A comparative study including phylogenetic, syntenic and expression analyses of Pax4, -6 and -10 genes in diverse vertebrates shed light on the asymmetric evolution of the Pax4/6/10 class of genes. Based on these results I reconstructed a likely evolutionary scenario that describes the secondary modifications in this gene family.

The ectodermal neural cortex (ENC) gene family, whose members are implicated in neurogenesis, is part of the kelch repeat superfamily. My analyses revealed that most vertebrates possess three distinct ENC genes derived from the 2R-WGD suggesting the loss of the forth subtype early in vertebrate evolution. Only eutherians secondarily lost ENC3. A comparison of the ENC1 expression patterns I obtained in shark with ENC1 expression profiles in tetrapods suggests a high level of conservation of developmental roles of this gene. Compared with many other gene families including key developmental regulators, the ENC gene family is unique in that conventional molecular phylogenetic inferences could not identify any obvious invertebrate ortholog. This suggests that the ENC gene family might have been too rapidly evolving to provide sufficient phylogenetic signals marking orthology to their invertebrate counterparts. Such gene families that experienced saltatory evolution likely remain unexplored, and might also have contributed to phenotypic evolution of vertebrates.

One aspect of my thesis focused on a recently identified sister gene of the key developmental genes Bmp2 and -4, designated Bmp16. This gene greatly differs from its well-investigated sister genes in two aspects. Firstly, the absence of Bmp16 in many vertebrate lineages (mammals, amphibians and archosaurs) is in stark contrast to the universal presence of Bmp2 and -4 in vertebrate genomes. Secondly, gene expression analyses of Bmp16 in teleosts (zebrafish), chondrichthyans (sharks) and reptiles (anoles) revealed a high degree of evolutionary plasticity that has never been documented for any Bmp2 or -4 gene. By using morpholino-induced knockdown techniques, I investigated to what extent sister genes are capable of compensating for the loss of a functional Bmp16 gene. This approach might allude to why this gene independently got lost at least three times during vertebrate evolution.

My thesis reveals recurrent patterns of gene family evolution in vertebrates. My detailed studies of selected gene families describe the dynamics that shaped the gene repertoires of extant vertebrates and thus contributed to phenotypic evolution leading to the biodiversity of vertebrates.

Meine Dissertation mit dem Titel ‚Charakterisierung von verborgenen Komponenten im Genom des Urwirbeltiers‘ hat das Ziel die Evolution der Erbinformationen im Laufe der stammesgeschichtlichen Entwicklung der Wirbeltiere zu rekonstruieren. Die zentrale Frage ist, welche genomischen Veränderungen die Entstehung neuer phänotypischer Merkmale begleiten und eventuell sogar hervorrufen. In diesem Ansatz liegt auch der Schlüssel für ein tieferes Verständnis der Evolution des menschlichen Genoms. Wirbeltiere grenzen sich von wirbellosen Tieren durch eine Reihe von Merkmalen ab. Phänotypisch beispielsweise unterscheiden sich Wirbeltiere von Wirbellosen durch ein komplex aufgebautes, dreigliedriges Gehirn, mit integrativen Zentren wie beispielsweise dem Telencephalon. Ebenfalls spezifisch für Wirbeltiere ist die embryonale Neuralleiste, welche zu kraniofazialen Strukturen beiträgt, die eine räuberische Lebensweise erst ermöglichen. Auf genomischer Ebene zeichnen sie sich durch eine zweifache Genomduplikation aus, welche sich im letzten gemeinsamen Vorfahren aller Wirbeltiere vor ca. 525 Millionen Jahren ereignete. Deshalb besaß das Urwirbeltier zunächst vier Kopien jedes Gens. Teile dieses überschüssigen genetischen Materials wurden im Laufe der Evolution vom Genom deletiert, oder Gene mutierten zu Pseudogenen, d. h. sie wurden funktionslos. Ein differenzieller Genverlust könnte zum Teil die unterschiedlichen phänotypischen Merkmale zwischen verschiedenen Wirbeltiergruppen erklären. Mein Ansatz liegt in der Untersuchung entwicklungsbiologisch höchst relevanter Genfamilien (Pax-, Hox-, Bmp- und ENC-Genfamilien) dessen Mitglieder nicht in allen Wirbeltiergruppen vorhanden sind.

Ein Teilprojekt befasst sich mit der berühmten Hox-Genfamilie, welche die positionalen Identitäten entlang der primären Körperachse im frühen Embryo spezifiziert. Das Hox14 Gen wurde bisher nur in einer Handvoll ursprünglicher Wirbeltiere (Haie, Schleimaal und Quastenflosser) identifiziert, und ich habe die Existenz von Hox14 im Australischen Lungenfisch nachgewiesen. Des Weiteren habe ich gezeigt, dass die Expression dieses Gens im Lungenfisch, genau wie im Hai und Schleimaal, vom sonst üblichen ‚Hox-code‘ entkoppelt ist.

Eine Studie beschäftigt sich mit Pax6, einem Gen welches als Hauptschalter für die Augenentwicklung in Bilateria gilt. Meine Forschung ergab, dass das Schwestergen Pax4, welches bisher nur bei Säugetieren identifiziert wurde, auch im Genom von Fischen (Teleostei), einem Quastenflosser und einigen Reptilien (Schildkröten und Krokodilen) vorhanden ist. Interessanterweise identifizierte ich ein bisher unbekanntes Gen, Pax10. Dies ist höchstwahrscheinlich neben Pax4 und Pax6 das dritte Gen des ursprünglichen Genquartetts aus der zweifachen Genomduplikation im Urwirbeltier. Eine vergleichende Studie bestehend aus phylogenetischen Untersuchungen, Synteny- und Genexpressionsanalysen von Pax4, -6 und -10 in verschiedenen Wirbeltieren ergab detaillierte Aufschlüsse über die asymmetrische Evolution der Pax4/6/10 Genklasse. Aus den Ergebnissen entwarf ich ein mögliches evolutionäres Szenario, welches die Veränderungen dieser Gengruppe im Laufe der Wirbeltierevolution rekonstruiert.

Mitglieder der ‚ectodermal neural cortex‘ (ENC)-Genfamilie, welche zur ‚kelch repeat‘ Superfamilie gehören, sind an der Neurogenese beteiligt. Meine Analysen zeigen, dass die meisten Wirbeltiere durch die zweifache Genomduplikation drei ENC Schwestergene besitzen, da ein Gen des ursprünglichen Quartetts vermutlich früh in der Wirbeltierevolution verloren ging. Lediglich Plazentatiere haben eines der ENC Gene (ENC3) sekundär verloren. Ein Vergleich meiner Expressionsanalyse des ENC1 Gens im Hai mit publizierten ENC1 Expressionsmustern in Landwirbeltieren legt den Schluss nahe, dass die entwicklungsbiologischen Aufgaben des Gens hochkonserviert sind. Im Vergleich zu vielen anderen Genfamilien ist die ENC-Genfamilie dahingehend einzigartig, dass konventionelle molekular-phylogenetische Methoden kein eindeutiges orthologes Gen in Wirbellosen identifizieren konnten. Möglicherweise evolvierte die ENC-Genfamilie zu schnell um ausreichend phylogenetisches Signal aufzubieten, welches Orthologie zu Genen von Wirbellosen erkennen ließe. Genfamilien wie diese, welche sprunghafte Evolution erfahren haben, neigen dazu unbeachtet zu bleiben, obwohl sie womöglich zur phänotypischen Evolution von Wirbeltieren maßgeblich beigetragen haben.

Ein Teil meiner Dissertation konzentriert sich auf das neu entdeckte Gen Bmp16, welches ein Schwestergen der entwicklungsbiologischen Schlüsselgene Bmp2 und -4 ist. Dieses Gen unterscheidet sich in zweierlei Hinsicht drastisch von seinen gut erforschten Schwestergenen. Erstens steht die Absenz von Bmp16 in einigen Wirbeltierlinien (Säugetiere, Amphibien und Archosaurier) in starkem Kontrast zur universellen Präsenz von Bmp2 und -4 in Wirbeltiergenomen. Zweitens zeigten Genexpressionsanalysen in Fischen (Zebrafisch), Knorpelfischen (Haie) und Reptilien (Anolisechsen) einen hohen Grad an evolutionärer Plastizität, welche nie zuvor für Bmp2 und -4 festgestellt wurde. Mit Gen-Knockdown-Techniken (Morpholinos) untersuchte ich, inwieweit Schwestergene den Verlust eines funktionalen Bmp16 Gens kompensieren können. Dieser Ansatz könnte Aufschluss darüber geben, weshalb dieses Gen im Laufe der Evolution mindestens drei Mal unabhängig voneinander verloren gegangen ist, nämlich in Amphibien, Archosauriern und Säugetieren.

Meine Dissertation enthüllt wiederkehrende Muster der Evolution von Genfamilien und zeigt die Dynamik welche das Genrepertoire moderner Wirbeltiere geformt hat. Diese Prozesse trugen zur phänotypischen Evolution bei, die zur heutigen Diversität an Wirbeltieren führte.