The development of new hybrid analytical methods comprising the significant recent advances of mass spectrometry (MS), promotes the versatility of MS applications in life science research. In particular, electrospray mass spectrometry (ESI-MS) has emerged as a powerful technique for analysing intact gas phase ions from large biomolecules and their complexes. However, in contrast to the already large number of ESI-mass spectrometric studies of protein structures and their modifications, mass spectrometric chacterisation and kinetic evaluation of interactions of biological complexes by ESI-MS has not yet been possible. The development of methods that combine biosensor and mass spectrometric structural characterisation of peptides and proteins with the kinetic characterisation of biopolymer complex formation was the main goal of this thesis.


The present thesis is divided into five parts. A first part focused on the development of a new method for the simultaneous mass spectrometric structural characterisation and the kinetic evaluation of protein- ligand interactions. Both an ESI- Ion trap mass spectrometer and a high resolution Fourier transform-ion cyclotron resonance-mass spectrometer (ESI-FTICR-MS) were successfully coupled with a Surface Acoustic Wave (SAW) biosensor. The interface developed for the online coupling of SAW with ESI-MS utilises a six-port valve micro-column and micro-injector for desalting and in-situ concentration of proteins after dissociated from the biopolymer complex. A second interface was developed that provides automatic switching of the two valves for transfer into the mass spectrometer. Several parameters were optimised including flow rates, buffers, and electrospray conditions for the ionisation process. The online SAW-ESI-MS approach was successfully validated and applied to tyrosine-nitrated peptides interacting with anti-3-nitrotyrosine (3-NT) antibodies and Lysozyme interacting with an anti- Lysozyme antibody.


The second part of this thesis was dealing with the identification of the epitope of tyrosine-nitrated peptides recognised by specific anti-3-NT antibodies. Tyrosine and nitro-tyrosine containing peptides from different protein sequences been identified to contain nitration sites in vivo and in vitro, were synthesised by solid-phase peptide synthesis. 3-NT was used with standard Fmoc and side-chain protection chemistry (t-butyl, trityl) and showed high coupling yields of crude peptides. The synthetic peptides were characterised by mass spectrometry and used in immuno-analytical studies. ESI-MS provided unambiguous identification of 3-NT containing peptides by the characteristic 45 Da mass shifts corresponding to the addition of NO2+. In contrast, UV-MALDI-MS of 3-NT containing peptides showed photochemical fragmentation at the nitro-phenyl group which hampers of impedes the unequivocal identification of tyrosine nitrations. Complemented by conventional immunoanalytical techniques (Dot blot, ELISA), affinity-mass spectrometry proved to be an efficient tool in the characterisation of recognition specificities of a monoclonal anti 3-NT antibody.


Affinity-MS, ELISA, and online SAW-ESI-MS revealed that the epitope depends not only on the nitrated tyrosine residue, but requires positively charged amino acids (Lys and/or Arg) in close proximity to the 3-NT residue. In contrast, neutral or negatively charged residues showed decreased binding affinity. The anti 3-NT antibody binding to tyrosine-nitrated Prostacyclin Synthase (PCS) peptides, as well as nitrated peptides derived from Eosinophil proteins (ECP, EDN and EPO), showed a similar motif with adjacent basic amino acids. These results suggest structural orientation of the nitrated tyrosine on the protein surface, and stabilising effect by surrounding positively charged amino acids. The capability of anti-3-NT antibodies to discriminate between nitro-tyrosine in different environments in proteins should be useful for producing antibodies to specific motifs and for the development of specific biomarkers.


Further interaction studies of the peptides binding to anti-3-NT antibodies were performed using a new methodology, hydrogen/deuterium amide exchange (HDX) to determine the binding affinity of antibodies for peptides. This method, based on a previously established method of protein-ligand interaction study by mass spectrometry, titration, and H/D exchange (PLIMSTEX), makes use of a dilution strategy (dPLIMSTEX), whereby the mass of the peptide ligand is the readout. Using this method, two monoclonal anti-3-NT antibodies were determined to have low nanomolar binding affinities to three nitrated PCS peptides. Additionally, the binding stoichiometry was determined.


The third part of the dissertation was devoted to applications of SAW-ESI-MS for the detection, structural identification and quantification of peptides bound to the calcium (Ca2+)-binding protein Calmodulin (CaM) complexed with Ca2+. The interaction of Calmodulin with enzymes is inhibited by a number of pharmacological agents and small basic polypeptides that share common structural features. Although the exact nature of calmodulin-enzyme interactions is not clear, a likely hypothesis is that Ca2+-binding to calmodulin exposes hydrophobic clefts which may be important in the binding of inhibitors and target enzymes.

Interaction studies of CaM with two peptides, Melittin and Substance P, were performed by online SAW-ESI-MS, and kinetic determinations performed together with the MS identification. Determination of Substance P-CaM and Mellitin-CaM association and dissociation kinetics was performed by extracting the data from the sensor signals for all concentrations employed, using the 1:1 binding model, and provided KD values of 44 nM for CaM-Substance P, and 16 nM for CaM-Mellitin.


A fourth part of the dissertation describes the SAW based detection of interactions of nucleotide transcription factor with Ets peptides. The Ets family of transcriptions factors is fundamental to development and homeostatic processes including DNA replication and repair, cell growth and division and apoptosis. A common feature of Ets proteins is a conserved 85 amino acid domain that binds specifically to double stranded DNA (dsDNA) containing a (G/A)(A/C)GGAAGT consensus sequence. Kinetic analysis of dsDNA binding Ets1 provided a low nanomolar KD value. Further quantification of affinity-bound transcription factor derived peptides to dsDNA was performed and showed different results from those obtained using a peptide microarray. The differences in the binding results can be explained by difference in the experimental setup between the two technologies employed. In the peptide microarray, a library of peptides is synthesised directly on 384-microwell plates and binding of the dsDNA is monitored by fluorescent detection. In the SAW technique, the dsDNA is covalently immobilised on the surface, and the binding of the various peptides is determined. The differing results by both technologies suggest that the conformation of the peptides is crucial for binding to dsDNA. Thus, in the microarray approach, the conformations of the peptide may be different from that of the peptides in solution, thus further studies may be required in order to understand these differences.


In the final part of this thesis, affinity studies RA33 peptides, specific for Rheumatoid Arthritis to a monoclonal anti-RA33 antibody, and autoantibody patient sera were performed. RA33, a major autoantigen in RA patients and anti-RA33 specific antibodies often appear shortly after the onset of RA. A previously identified RA33 epitope was characterised by SAW biosensor using a monoclonal anti-RA antibody and a KD in the low nanomolar range was determined. Further interaction studies of RA33 derived peptides were performed with RA patient sera samples. The peptides were covalently immobilised on a carboxyl surface and the interaction of 1:200 patient sera determined by the SAW biosensor. The peptide identified in the interaction with the monoclonal anti-RA33 antibody was found to have the highest affinity to the patient samples. Bioaffinity measurements performed using the SAW technology showed to be highly sensitive in the detection of the autoantibodies present in patient sera.

Die Entwicklung neuer analytischer Hybridmethoden in Verbindung mit den jüngsten bedeutenden Fortschritten der Massenspektrometrie (MS), hat wesentliche Auswirkung auf die Vielseitigkeit von Anwendungen der Massenspektrometrie in den Lebenswissenschaften. Vor allem die Elektrospray-Massenspektrometrie (ESI-MS) hat sich als leistungsfähige Technik zur Analyse von intakten Gasphasenionen von großen Biomolekülen und deren Komplexen erwiesen. Im Gegensatz zu den bereits zahlreichen ESI-massenspektrometrischen Untersuchungen von Proteinstrukturen und deren Modifikationen, war die massenspektrometrische Charakterisierung und kinetische Charakterisierung der Wechselwirkung von biologischen Komplexen durch ESI-MS bisher nicht möglich. Die Entwicklung von Methoden, die Biosensor und massenspektrometrische strukturelle Charakterisierung von Peptiden und Proteinen mit der kinetischen Charakterisierung der Komplexbildung von Biopolymeren kombinieren, war ein Hauptziel dieser Arbeit.


Die vorliegende Arbeit ist in fünf Abschnitte aufgeteilt. Der erste Abschnitt befasst sich mit der Entwicklung einer neuen bioanalytischen Methode, welche die simultane massenspektrometrische strukturelle Charakterisierung und die kinetische Untersuchung von Protein-Ligand-Wechselwirkungen ermöglicht. Ein ESI-Ionenfallen-Massenspektrometer (ESI-MS) sowie ein hochauflösendes Elektrospray-Fouriertransform-Ionenzyklotronresonanz-Massenspektrometer (ESI-FTICR-MS) wurden herzu mit einem akustischen Wellen- (SAW) Biosensor gekoppelt. Das für die online Kopplung entwickelte Interface nutzt ein 6/2 Wege-Ventil, eine Mikrosäule und eine Mikro-Einspritzung zur Entsalzung und in-situ Konzentrierung von Proteinen, welche aus dem Komplex dissoziiert sind. Ein zweites Interface wurde entwickelt, das eine automatisierte Schaltung der Ventile ermöglicht. Verschiedene Parameter wie Durchfluss, Puffer und Elektrospray-Bedingungen für die Ionisation wurden optimiert. Die online SAW-ESI-MS Methode wurde erfolgreich zur Untersuchung der Wechselwirkungen von Tyrosin-nitrierten Peptiden mit anti-3-Nitrotyrosin (3-NT) Antikörpern und Lysozym mit anti-Lysozym Antikörpern validiert und angewendet.


Der zweite Abschnitt dieser Arbeit behandelt die Identifizierung des Epitops von Tyrosin-nitrierten Peptiden durch spezifische anti 3-NT Antikörper. Tyrosin- und Nitro-Tyrosin-enthaltende Peptide aus verschiedenen Protein-Sequenzen, deren Nitrierungsstellen in vivo und in vitro identifiziert wurden, wurden durch Festphasen-Peptidsynthese nach der Fmoc-Strategie synthetisiert. 3-NT wurde mit Standard Fmoc und Seitenkettenschutzgruppen Chemie (t-Butyl, Trityl) verwendet und ermöglichte hohe Kupplungsausbeuten der Rohpeptide. Die synthetischen Peptide wurden durch Massenspektrometrie charakterisiert und in Immuno-analytischen Untersuchungen angewendet. ESI-MS ermöglichte die eindeutige Identifizierung von 3-NT enthaltenen Peptiden durch die Massenerhöhung um 45 Da für die Addition von NO2. In Gegensatz dazu zeigte die UV-MALDI-MS, dass 3-NT- enthaltende Peptid eine photochemische Fragmentierung an der Nitrophenyl-Gruppe eingehen, die eine eindeutige Identifizierung der Tyrosin-Nitrierung erschwert oder sogar verhindert. Als Ergänzung zu konventionellen Immunoanalytischen Methoden wie Dot Blot und ELISA, erwies sich die Affinitäts-Massenspektrometrie als eine leistungsfähige Methode zur Charakterisierung von Erkennungsspezifitäten von Anti-3-NT Antikörpern.
Affinitäts-MS, ELISA und online-SAW-ESI-MS zeigten, dass das Epitop nicht nur ein nitriertes Tyrosin umfasst sondern auch das Vorliegen von positiv geladenen Aminosäuren (Lys und / oder Arg) in Nachbarschaft zur 3-NT Aminosäure erfordert. Neutrale oder negativ geladene N-terminale Reste zeigten deutlich verringerte Bindungsaffinitäten im Vergleich zu denjenigen mit positiv geladenen Resten. Die anti-3-NT Antikörperbindung an Tyrosin-Nitro-Prostacyclin-Synthase (PCS)-Peptide, sowie nitreirte-Peptide von Eosinophil-Proteinen (ECP, EDN und EPO) zeigten ähnliche Motive mit benachbarten basischen Aminosäuren. Diese Ergebnisse weisen auf eine strukturelle Ausrichtung des nitrierten Tyrosins an der Proteinoberfläche und eine stabilisierende Wirkung durch umgebende positiv geladene Aminosäuren hin. Die Fähigkeit des anti-3-NT Antikörpers zwischen Nitro-Tyrosin in verschiedenen Umgebungen in Proteinen zu unterscheiden, sollte zur Herstellung von Antikörpern für spezifische Motive und für die Entwicklung von spezifischen Biomarkern nützlich sein.


Weitere Wechselwirkungsstudien der Peptide mit anti-3-NT Antikörpern wurden mittels einer neuen Methode durchgeführt, die auf der Wasserstoff/Deuterium Austauschreaktion (HDX) basiert, um die Bindungsaffinitäten von Antikörpern zu den Peptiden zu bestimmen. Dieses Verfahren basiert auf einer Methode zur Untersuchung von Protein-Ligand Wechselwirkungen durch Massenspektrometrie, Titration und H/D Austausch (PLIMSTEX), und benutzt eine Verdünnungsstrategie (dPLIMSTEX) bei der die Masse des Peptid-Liganden ausgelesen wird. Mit dieser Methode wurden die Bindungsaffinitäten von zwei Antikörpern mit nitrierten Peptiden im nanomolaren Bereich bestimmt, und zusätzlich die Bindungsstöchiometrie bestimmt.


Der dritte Abschnitt der Dissertation befasst sich mit Anwendungen der SAW-ESI-MS zum direkten Nachweis und zur strukturellen Charakterisierung und Quantifizierung von Peptiden ermöglichen, die an das Kalzium (Ca2+)-bindende Protein Calmodulin gebunden sind, welches mit Ca2+ auf einem Biosensor-Chip komplexiert ist. Die Wechselwirkung von Calmodulin mit Enzymen wird durch eine Reihe von pharmakologischen Wirkstoffen und basischen Polypeptiden mit gemeinsamen strukturellen Merkmalen gehemmt. Obwohl die genaue Art der Calmodulin-Enzym-Wechselwirkungen nicht geklärt ist, ist die wahrscheinlichste Hypothese, dass die Ca2+-Bindung an Calmodulin hydrophobe Bereiche freilegt, welche für die Bindung von Calmodulin-Inhibitoren an Zielenzyme von Bedeutung sind. Daher wurden die Untersuchungen der Wechselwirkung von CaM mit zwei Peptiden, Melittin und Substanz P, mittels online-SAW-ESI-MS durchgeführt, so dass die kinetischen Auswertungen gleichzeitig mit der MS-Identifizierung und strukturellen Charakterisierung möglich waren. Die Bestimmung der Dissoziationskonstanten von Substanz P-CaM und Mellitin-CaM wurde durch Extrahieren der Daten aus den Sensorsignalen für alle verwendeten Konzentrationen durchgeführt, wobei ein 1:1-Bindungsmodell verwendet wurde. Die lineare Regression der resultierenden kobs Werte gegen die CaM Konzentration ergab einen KD Wert von 44 nM für Substanz P-CaM und 16 nM für Mellitin-CaM.


Der vierte Abschnitt der Arbeit befasst sich mit der SAW basierte Ermittlung von Bindungs-Wechselwirkungen von Nukleotid-Transkriptionsfaktoren mit Ets-Peptiden. Die Ets-Familie von Transkriptionsfaktoren sind grundlegend für die Entwicklung von homöostatischen Prozessen wie DNA Replikation und Reparatur, Zellwachstum und Zellteilung, Kontrolle der Apoptose und Zelldifferenzierung. Daher können angeborene oder erworbene Defekte in der Struktur und Funktion des Transkriptionsfaktors zur Krebsentstehung beitragen. Das gemeinsame Merkmal der ETS-Proteine ist eine hoch konservierte 85-Aminosäuren-Protein-Domäne, die spezifisch an doppelsträngige DNA (dsDNA) bindet, welche eine (G/A)(A/C)GGAAGT Konsensussequenz besitzen. Die kinetische Analyse der dsDNA Bindung an Ets1 ergab einen nanomolaren KD Wert. Weitere Peptide, abgeleitet vom Transkriptionsfaktor, wurden an dsDNA Affinitäts-gebunden und quantifiziert. Die mittels SAW bestimmten Bindungsaffinitäten dieser Peptide an dsDNA ergab andere Ergebnisse als bei Peptid- Mikroarrays, die durch Unterschiede im Assay-Format der beiden Technologien erklärt werden können, da im Peptid-Mikroarray eine Bibliothek von Peptiden direkt auf-Mikrotiterplatten synthetisiert und die Bindung der dsDNA durch Fluoreszenzdetektion verfolgt wird. In der SAW-Technologie wird die dsDNA dagegen kovalent auf der Oberfläche immobilisiert und die Bindung der verschiedenen Peptide direkt (ohne Fluoreszenzmarkierung) gemessen. Die beobachteten Unterschiede weisen darauf hin, dass die Konformation der Peptide für die Bindung an dsDNA wesentlich ist. In dem Mikroarray-Ansatz könnte die Konformation der Peptide sich von der des freien Peptids in Lösung unterscheiden.


Im letzten Teil dieser Arbeit wurden Affinitäts-Bindungs-Studien von RA33 Peptiden an einen monoklonalen anti-RA33 Antikörper und Autoantikörper-Serum aus Rheumatoider Arthritis durchgeführt. Das RA33 ist ein wichtiges Autoantigen bei RA-Patienten und anti-RA33 spezifische Antikörper erscheinen oft kurz nach Beginn der Rheumatoiden Arthritis. Ein zuvor identifiziertes RA33 Epitop wurde durch SAW-Biosensor unter Verwendung eines monoklonalen anti-RA Antikörpers charakterisiert und ein KD im nanomolaren Bereich wurde bestimmt. Weitere Studien zu Wechselwirkungen von RA33-Peptiden mit RA Patientenserum wurden durchgeführt. Die Peptide wurden dazu kovalent auf eine SAM-COOH Oberfläche gebunden und die Wechselwirkung mit Patientenserum im Verhältnis von 1:200 mittels SAW Biosensor bestimmt. Das Peptid in Wechselwirkung mit dem monoklonalen anti-RA33 Antikörper, zeigte die höchste Affinität zu den Patientenproben. Bioaffinitäts-Messungen mittels SAW-erwiesen sich als sehr empfindlich zum Nachweis der Autoantikörper in dem Patientenserum.