Human papillomaviruses (HPVs) are small double-stranded DNA viruses that infect cutaneous and mucosal epithelial cells. Mucosal HPVs can be divided in high risk and low risk types depending on their association with clinical lesions. Infection with high risk types can lead to the development of cervical cancer, whereas infection with low risk types induces the formation of benign genital tumors. E6 proteins of high risk HPVs contribute to the development of cervical cancer by utilizing the cellular ubiquitin ligase E6AP to target the tumor suppressor p53 and several other cellular proteins for degradation. In contrast, E6 proteins of low risk HPVs are only weakly oncogenic and only little is known about their biochemical and physiological properties.

In order to obtain further insights into the role of the high risk and low risk E6 proteins in the development of cervical cancer and benign tumors, in the first part of this thesis, the HPV E6 proteins were analyzed with respect to their influences on the “proteome” and “ubiquitome” of cells. In addition, interaction partners of HPV E6 were identified. To determine changes on proteomes upon expression of E6 proteins (“HPV E6 proteome”), we developed an inducible expression system that allows switching on and off E6 expression within cells. We used this system combined with quantitative mass spectrometry (stable isotope labeling of amino acids in cell culture, SILAC) and determined the effect of different E6 proteins on the protein expression pattern of a cell in general. For the identification of proteins that are ubiquitylated in an E6-dependent manner (“HPV E6 ubiquitome”), an in cellulo assay using tandem ubiquitin binding entities (TUBEs) as stabilization and isolation tool of ubiquitylated proteins was established. For the “interactome” studies (proteins that interact with E6), pulldown experiments with GST-tagged E6 and cell lysates from cells that do or do not express E6AP in combination with quantitative mass spectrometry (SILAC) were performed. With this approach, three subunits of the Anaphase Promoting Complex (APC/C) among others were identified as interaction partners of E6. APC/C is an E3 ligase whose major role is controlling the cell cycle. The interaction between APC/C and the HPV E6 proteins could be verified. However, further investigations are necessary to elucidate the physiological function of this interaction. In conclusion, this study contributes to the elucidation of the cellular pathways that are affected by both low risk and high risk E6 proteins.

In the second part of this thesis we showed that the E6 interacting protein LNX1 is able to bind to the tumor suppressor p53 and that it induces ubiquitylation and degradation of p53 in an E6-independent manner. p53 is a tightly regulated protein and has critical functions including regulation of cell death, senescence and proliferation. Our data show that an additional E3 ligase, LNX1 is involved in the regulation of p53.

Humane Papillomaviren (HPVs) sind kleine doppelsträngige DNA Viren, die kutane und muköse Epithelzellen infizieren. Muköse HPVs werden aufgrund ihres onkogenen Potenzials in Hoch-Risiko (high risk) und Niedrig-Risiko (low risk) -Typen unterteilt. Infektionen mit high risk HPVs können zur Entstehung von Zervixkarzinomen führen; die Folge einer Infektion mit low risk HPVs ist die Entstehung von gutartigen Tumoren. High risk E6 Proteine spielen bei der Entstehung von Zervixkarzinomen eine große Rolle: sie binden an die zelluläre E3-Ligase E6AP und induzieren dadurch den Abbau von p53 und weiteren zellulären Substraten. Im Gegensatz dazu besitzen die E6 Proteine der low risk HPV-Typen nur eine sehr geringe onkogene Wirkung. Über ihre biochemischen sowie physiologischen Funktionen ist bislang nur sehr wenig bekannt. Um neue Einblicke in die Rolle von high risk und low risk E6 Proteinen in der Entstehung von Zervixkarzinomen und gutartigen Tumoren zu gewinnen, wurden im ersten Teil dieser Arbeit E6 Proteine von high risk und low risk HPV-Typen hinsichtlich ihres Einflusses auf das “Proteom“ und “Ubiquitom“ untersucht. Weiterhin wurden HPV E6 Interaktionpartner identifiziert. Zur Untersuchung des Einflusses von E6 auf das “Proteom“ einer Zelle wurde ein induzierbares Expressionssystem entwickelt, mit dem die Expression der E6 Proteine in Zellen an- und ausgeschaltet werden kann. In Kombination mit quantitativer Massenspektrometrie (SILAC, stable isotope labeling of amino acids in cell culture) wurden mit diesem System Effekte von verschiedenen E6 Proteinen auf die Expressionslevel der zellulären Proteine im Allgemeinen analysiert (“HPV E6 Proteom“). Um Proteine, die E6-abhängig ubiquitiniert werden (“HPV E6 Ubiquitom“), zu identifizieren, wurde mit Hilfe von TUBEs (tandem ubiquitin binding entities) ein in cellulo Assay etabliert, bei dem TUBEs als Stabilisierungs- und Isolierungstool für ubiquitinierte Proteinev dienen. Zur Bestimmung neuer Interaktionspartner der E6 Proteine (“HPV E6 Interaktom“) wurden Bindeassays mit GST-getaggtem E6 Protein und Lysaten von Zellen, die entweder E6AP exprimieren, oder nicht, kombiniert mit quantitativer Massenspektrometrie (SILAC) durchgeführt. Im Zuge dieser Bindeassays konnte unter anderem drei Untereinheiten der E3 Ligase APC/C als Interaktionspartner für E6 identifiziert werden. APC/C ist eine E3 Ligase, die eine wichtige Rolle in der Zellzyklusregulation spielt. Die Interaktion von E6 mit APC/C konnte verifiziert werden, jedoch muss die physiologische Funktion dieser Interaktion noch weiter untersucht werden. Schlussfolgernd hat diese Arbeit zur Aufklärung der Funktionen der E6 Proteine von high risk und low risk HPV-Typen und deren Einfluss auf zelluläre Signalwege beigetragen.

Im zweiten Teil dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die mit E6-interagierende E3 Ligase LNX1 in der Lage ist, den Tumorsuppressor p53 zu binden und dass LNX1 die Ubiquitinierung und den Abbau von p53 induziert. Dies geschieht in einem E6-unabhängigen Mechanismus. p53 ist ein stark reguliertes Protein und spielt eine wichtige Rolle in verschiedenen zellulären Prozessen, wie Zelltod, Seneszenz und Proliferation. Unsere Daten zeigen, dass eine weitere E3 Ligase, LNX1, in der Regulation von p53 involviert ist.