The high substrate specificity of replicative DNA polymerases is essential in order to maintain the stability of a cell’s genome.[160] But furthermore, it is fundamental to understand how a DNA polymerase can adapt to or discriminate between aberrant or non-cognate substrates present in various biological processes. The evolution of DNA polymerases towards an enhanced acceptance of non-cognate substrates is also a paramount goal of directed enzyme evolution, as these enzymes pave the way for various biotechnological applications. In this study, the focus is on KlenTaq DNA polymerase adapting to abasic sites present in DNA and on the processing of RNA as a non-cognate substrate.


In the first part of this work, the enzyme’s incorporation mechanism opposite an abasic site was investigated. Abasic sites are the result of a spontaneous or enzymatic loss of the nucleobase and are the most common damage in DNA observed under physiological conditions.[76] Although they are non-instructive, DNA polymerases from family A and B preferentially incorporate dAMP opposite the lesion, a phenomenon termed ‘A-rule’.[78, 83, 84, 97-100, 102] This preference results in transversion mutations often found in human cancers.[112] Thus, it is vital to understand how DNA polymerases process these lesions and why dAMP is preferred. Superior desolvation and stacking interactions of adenine were always thought to be the major determinants for the ‘A-rule’.[108, 109] However, Dr. Samra Obeid was able to obtain crystal structures of KlenTaq in complex with an abasic site analogue containing template, which suggested a possible bypass mechanism as well as the mechanistic origin for the purine selectivity of this DNA polymerase.[72] A highly conserved amino acid side chain (Tyr671) was suggested to replace the missing nucleobase in the template strand and mimic a six membered pyrimidine nucleobase in shape and size, thus directing for purine incorporation in order to maintain an optimal geometric fit at the active site. But, crystal structure analysis only provides a static view of nucleotide incorporation. For further evidence that an ‘amino acid templating’ mechanism is facilitating the incorporation of purines, functional studies were required and performed in this work. By mutating the tyrosine at position 671 via site-directed mutagenesis, variants were generated and subsequently analysed in primer extension experiments as well as kinetic studies to further corroborate the important role of this side chain in abasic site bypass.
Analysis of a Y671A variant demonstrated the significance of the aromatic moiety at this position in general, whereas a Y671F mutant highlighted the importance of hydrogen bond formation between the cognate tyrosine’s hydroxyl group and the N3 of the incoming adenine. Incorporation studies of a modified nucleotide, namely 3-deaza-2’-deoxyadenosine-5’-triphosphate (d3DATP), opposite an abasic site, as well as primer extension experiments with a variant containing 2,3,5-fluorotyrosine at position 671, further confirmed the stabilizing effect of the hydrogen bond formed.


Analysis of a Y671W mutant provided the most compelling evidence that indeed an ‘amino acid templating’ mechanism is at work with an optimal geometric fit at the active site as the major determinant. In detail, primer extension experiments and kinetic analysis of Y671W revealed that the purine selectivity could be switched to preferential pyrimidine incorporation. It is assumed that the bicyclic indole, consisting of a six‐membered ring fused to a five‐membered ring, mimics the approximate size and shape of a purine and in consequence directs for pyrimidine incorporation to conserve the geometric fit at the active site. Thus, the functional studies corroborated the lesion bypass mechanism derived from the crystal structure analysis.


In a second aspect of this work, template-independent addition of nucleotides at blunt-ended DNA was investigated.[107] The high preference for dAMP incorporation at blunt-ended DNA resembles the incorporation opposite an abasic site. Crystal structure analysis performed by Dr. Samra Obeid revealed the same arrangement in the active site of the enzyme with Tyr671 directing for preferential purine incorporation. Functional studies performed in this work with the tryptophane mutant Y671W corroborated these findings in primer extension and kinetic studies.



In the second project of this work, the acceptance of another non-cognate substrate of KlenTaq DNA polymerase was investigated. In general, the substrate selection of a DNA polymerase is a very stringent process;[160] the acceptance of non-cognate substrates, however, facilitates new applications in biotechnology, molecular biology and diagnostics. This part of my work focused on the ability of the DNA-dependent DNA polymerase KlenTaq to accept or exclude the non-cognate template RNA regarding two different aspects. First, the idea was to develop a KlenTaq variant which is able to accept DNA and RNA as the templating nucleic acid, thus facilitating the enzyme’s application in reverse transcription PCR (RT-PCR), resulting in it being a valuable tool in transcriptome analysis, in pathogen detection as well as in disease-specific marker recognition.[14] Second, we wanted to obtain insights into the fundamental biological question of how a DNA-dependent DNA polymerase can discriminate between DNA and RNA as a templating nucleic acid.


The detection and quantification of RNA in RT-PCR is generally mediated by two enzymes: a reverse transcriptase and a PCR-competent DNA polymerase. However, several drawbacks arise from the heat-instability of retroviral reverse transcriptases.[143] Thus, the use of one enzyme, a thermostable DNA-dependent DNA polymerase capable of reverse transcription, would offer the possibility to perform one step RT-PCR at high temperatures minimizing secondary structure formation of RNA,[142] enhance specificity[142] and, in general, supersede the use of two enzymes, thereby eliminating problems such as inhibitory effects between a reverse transcriptase and a DNA polymerase.[152-154] An additional reverse transcription step, necessary for the reverse transcriptase, could be omitted, further providing a work and time reduction.


For this purpose, two KlenTaq mutants, M1 (L322M, L459M, S515R, I638F, S739G, E773G) and M747K, exhibiting some reverse transcriptase[148] and lesion bypass activity,[159] were recombined by DNA shuffling. Screening of the generated library for PCR and reverse transcriptase activity yielded enzyme mutants with properties by far exceeding the parental enzymes. Sequencing and functional characterization of the most promising variants indicated that four mutations (L459M, S515R, I638F and M747K) are important for the observed increase in reverse transcriptase activity. One mutant which featured one mutation less showed an overall loss in enzyme activity, whereas variants with more mutations resulted in no gain in reverse transcriptase activity.


In summary, we gained a new generation of KlenTaq variants which exhibit an up to 20-fold gain in reverse transcriptase activity compared to the parental variant KTq M1, and a more than 100-fold increase compared to KTq M747K. The results suggest a surprising synergistic effect of the mutations. Further RT-PCR experiments with the purified enzymes confirmed the superior reverse transcriptase activity of the identified variants. RT-KTq 2, which possesses the most promising mutations L459M, S515R, I638F and M747K, was selected for in depth-analysis. The enzyme was successfully applied in real-time multiplex RT-PCR, facilitating rapid detection of influenza viruses A and B. Thus, it provides a valuable tool for rapid RT-PCR, crucial e.g. in important fields of clinical diagnostics such as point of care testing, as a reverse transcription step can be omitted and preceding reaction condition optimizations for a reverse transcriptase and a DNA polymerase are redundant. The thermostable enzyme further offers the possibility to perform RT-PCR at high temperatures, preventing unspecific priming and secondary structure formation of mRNA. The full-length enzyme of the variant showed further promising properties which facilitates its future application in TaqMan based RT-PCR.
Few thermostable enzymes capable of both reverse transcription and PCR are commercially available,[147, 151] probably also due to the lack of knowledge regarding the mechanism of how DNA-dependent DNA polymerases discriminate between the templating nucleic acids DNA and RNA. Therefore, it is difficult to rationally design such DNA polymerases. The lack of knowledge is due to the fact that structural data of DNA-dependent DNA polymerases, whose wild-type parental ancestors show no significant reverse transcriptase activity, processing RNA is not available. Thus, we set out to crystallize KlenTaq DNA polymerase in complex with RNA as substrate to get insights into the fundamental question how DNA-dependent DNA polymerases discriminate between the templating nucleic acids DNA and RNA.
Although crystallization trials of KlenTaq wild-type in complex with a DNA/RNA hybrid failed, we were able to obtain crystals of the RT-KTq 2 variant in complex with an all DNA as well as a DNA/RNA hybrid duplex and could solve the structures. For the first time, we received insights into how a DNA-dependent DNA polymerase processes RNA. Together with Dipl.-Biol. Konrad Bergen, we identified the crucial role of the mutations present in the enzyme variant which enabled the mutant to accommodate the distinct geometry of the hybrid duplex, allowing an efficient processing of RNA as template. Consequently, we also gained insights into the restraints present in the wild-type enzyme which prevent efficient RNA processing.
The L459M mutation contributes to prevent the clash of the thumb domain with the hybrid duplex and facilitates the nucleotide binding motif in the thumb domain to maintain its interactions with the nucleic acid duplex. Furthermore, the S515R mutation stabilizes this motif by interacting with surrounding amino acid residues. Whereas the role of I638F is difficult to predict, we suggest that the M747K mutation increases the positively charged surface potential in the proximity of the negatively charged substrate backbone and thus enhances the acceptance of non-cognate substrates by electrostatic interactions.


A last aspect of this work focused on the increased substrate spectra of the new KlenTaq variants. With these enzymes in hand, many applications come to mind. The increased lesion bypass activity makes them valuable tools for paleontological, archaeological or forensic studies in which damaged DNA has to be processed in PCR reactions.[217] The high error-rate combined with the ability to perform PCR would allow the generation of mutated genes that are useful e.g., for directed enzyme evolution.[122]



This work consisted of two major studies which both investigated DNA synthesis by KlenTaq DNA polymerase from two aberrant substrates, abasic site containing templates and RNA. Both studies give insights into the nature of template processing by DNA polymerases: In general, one can conclude that these enzymes possess a certain flexibility to adapt to non-cognate substrates. This flexibility can be altered or enhanced by directed enzyme evolution. In detail, an amino acid residue assumes the role of the templating nucleobase in abasic site bypass and directs for preferential purine incorporation. However, mutation of this residue still allowed the enzyme to bypass the lesion, but altered the enzyme’s bypass behaviour towards preferential pyrimidine incorporation. Additionally, the poor processing of RNA as template by KlenTaq DNA polymerase was enhanced by introducing specific mutations into the enzyme. Thus, the intrinsic poor binding and processing of the non-cognate substrate RNA was efficiently increased by directed enzyme evolution and resulted in the enzyme’s high reverse transcriptase activity.
In this work, directed enzyme evolution also facilitated the investigation of biological processes and mechanisms. Mutating the tyrosine residue 671 to tryptophane approved a proposed model for the ‘A-rule’. Furthermore, evolution of KlenTaq DNA polymerase wild-type towards a mutant capable of processing RNA allowed insights into the restrictions present in the wild-type enzyme, which might be responsible for discriminating between the two templates DNA and RNA. Thus, by directed enzyme evolution, insights were gained into fundamental principles of DNA synthesis.

Die hohe Substratspezifität von DNA Polymerasen ist essentiell, um die Stabilität des Genoms einer Zelle aufrechtzuerhalten.[160] Aber darüber hinaus ist es wichtig zu verstehen, wie DNA-Polymerasen in der Lage sind, sich an nicht-natürliche Substrate, die in diversen biologischen Prozessen vorkommen, anzupassen oder gegen sie zu diskriminieren.


Des weiteren ist die Evolution von DNA-Polymerasen, hin zu einer erweiterten Akzeptanz von nicht-natürlichen Substraten, auch ein vorrangiges Ziel der gerichteten Enzymevolution, da diese Enzyme in diversen Bereichen der Biotechnologie Anwendungen finden würden. Im Fokus dieser Arbeit steht die Anpassung an, in der DNA vorkommende, abasische Stellen und die Prozessierung von RNA als nicht-natürliches Substrat durch die KlenTaq DNA-Polymerase.



Der erste Teil dieser vorliegenden Arbeit befasst sich mit der Frage, welcher Mechanismus dem Nukleotideinbau gegenüber abasischen Stellen zu Grunde liegt. Abasische Stellen sind das Resultat eines spontanen oder enzym-katalysierten Verlustes der Nukleobase und stellen die häufigste Art von DNA-Schäden unter physiologischen Bedingungen dar.[76] Obwohl abasische Stellen die genetische Information, die in der Nukleobase gespeichert war, verloren haben, bauen DNA-Polymerasen der Familien A und B bevorzugt dAMP gegenüber einer solchen DNA-Läsion ein.[78, 83, 84, 97-100, 102] Ein Phänomen das als „A-rule“ bezeichnet wird. Diese Präferenz für dAMP führt jedoch zu Transversionsmutationen, die oft mit Krebs in Verbindung gebracht werden.[112] Daher ist es essentiell zu verstehen, wie DNA-Polymerasen diese Läsionen prozessieren und warum dAMP bevorzugt wird. Die besseren Desolvatisierungseigenschaften sowie die besseren - Wechselwirkungen von Adenin wurden bisher als die bestimmenden Faktoren für die „A-rule“ angesehen.[108, 109] Dr. Samra Obeid war jedoch in der Lage Kristallstrukturen der KlenTaq DNA-Polymerase im Komplex mit einem Templat, das eine abasische Stelle enthält, zu erhalten.[72] Diese Kristallstruktur deutet auf einen möglichen Mechanismus hin, durch welchen erklärt werden kann, wie das Enzym die DNA-Läsion überliest und worin die Präferenz für Purine begründet liegt: Eine hoch konservierte Seitenkette (Tyr671) soll die fehlende Nukleobase im Templatstrang ersetzen.[72] Durch ihre Ähnlichkeit mit einer Pyrimidinnukleobase bezüglich ihrer Form und Größe wird dadurch der Einbau von Purinen bevorzugt, da dadurch die geometrische Form des aktiven Zentrums nicht beeinträchtigt wird. Die Kristallstrukturanalyse bietet jedoch nur eine Momentaufnahme des Einbaus von Nukleotiden. In diesem Teil der Arbeit wurden funktionelle Studien durchgeführt, um weitere Anhaltspunkte zu finden, die einen Protein-Templat-Mechanismus als zugrunde liegenden Faktor für die Präferenz des Purineinbaus bestätigen. Durch die Mutation des Tyrosins an der Stelle 671 über zielgerichtete Mutagenese, wurden Polymerase-Varianten generiert, die anschließend in Primerverlängerungsreaktionen und kinetischen Studien untersucht wurden. Diese Studien belegten die wichtige Rolle der Seitenkette im Überlesen von abasischen Stellen.


Die Analyse einer Y671A-Variante demonstrierte die Bedeutung des aromatischen Restes an dieser Position im Allgemeinen, während eine Y671F-Variante die Wichtigkeit einer bestehenden Wasserstoffbrücke zwischen der Hydroxylgruppe des natürlichen Tyrosins und dem N3 des eintretenden dAMP verdeutlichte. Sowohl Einbaustudien des modifizierten Nukleotids 3-Deaza-2’-desoxyadenosin-5’-triphosphat (d3DATP) gegenüber einer abasischen Stelle, als auch Primerverlängerungsreaktionen mit einer Variante, bei welcher das Tyrosin an der Stelle 671 mit einem 2,3,5-Fluorotyrosin ersetzt wurde, belegten das Vorhandensein und die stabilisierende Wirkung der gebildeten Wasserstoffbrücke.


Die Analyse einer Y671W-Variante lieferte jedoch den überzeugendsten Beweis dafür, dass ein Protein-Templat-Mechanismus, mit geometrischen Beschränkungen als wichtigster Faktor, dem Ganzen zu Grunde liegt. Im Einzelnen zeigte die Analyse der Primerverlängerungsreaktionen und der kinetischen Studien der Y671W-Variante, dass der bevorzugte Einbau von Purinen umgekehrt werden kann, sodass Pyrimidine bevorzugt als Substrat akzeptiert werden. Es wird vermutet, dass das Indolsystem des Tryptophans, welches aus einem mit einem Fünfring gekoppeltem Sechsring besteht, der Größe und Form eines Purins ähnelt und daher bevorzugt Pyrimidine eingebaut werden, um eine optimale Anpassung innerhalb des aktiven Zentrums zu gewährleisten. Dadurch konnte der in der Kristallstruktur angedeutete Mechanismus über in dieser Arbeit durchgeführte funktionelle Studien bestätigt werden.


Ein anderer Gesichtspunkt dieser Arbeit bestand in der Eigenschaft von DNA-Polymerasen einen templatunabhängigen 3’-Überhang zu generieren.[107] Der templatunabhängige, bevorzugte Einbau von dAMP am 3‘-Ende der DNA erinnert an den Einbau gegenüber einer abasischen Stelle. Die von Dr. Samara Obeid durchgeführte Kristallstrukturanalyse offenbarte dieselbe Anordnung im aktiven Zentrum des Enzyms, die wiederum nahelegte, dass die Tyrosinseitenkette an Position 671 verantwortlich für den bevorzugten Einbau von Purinen war. Funktionelle Studien der Y671W-Variante, im speziellen Primerverlängerungsreaktionen und kinetische Studien, die in dieser Arbeit durchgeführt wurden, belegten die aus der Kristallstruktur gewonnenen Erkenntnisse.



Der zweite Teil dieser Arbeit befasst sich mit der Akzeptanz eines anderen nicht-natürlichen Substrates durch die KlenTaq DNA-Polymerase. Im Allgemeinen ist die Substratselektion einer DNA-Polymerase ein sehr stringenter Prozess.[160] Jedoch eröffnet die Akzeptanz von nicht-natürlichen Substraten neue Anwendungen in der Biotechnologie, der Molekularbiologie und der Diagnostik. Dieser Teil meiner Arbeit befasst sich mit der Fähigkeit der DNA-abhängigen DNA-Polymerase KlenTaq das nicht-natürliche Templat RNA zu akzeptieren bzw. auszuschließen. Dies wurde hinsichtlich zwei verschiedener Gesichtspunkte untersucht. Zum einen war es das Ziel eine KlenTaq-Variante zu entwickeln, die in der Lage ist, sowohl DNA als auch RNA als Templat zu akzeptieren. Dies würde die Anwendung des Enzyms in reverser Transkriptions PCR (RT-PCR) ermöglichen und es zu einem wichtigen Werkzeug für die Transkriptomanalyse oder für die Erkennung von Pathogenen und krankheitsspezifischen Markern werden lassen.[14] Zum anderen wollten wir Einblicke in die grundlegende biologische Frage, wie eine DNA-abhängige DNA-Polymerase zwischen den Nukleinsäuretemplaten DNA und RNA unterscheiden kann, erhalten.


Die Detektion und Quantifizierung von RNA wird in RT-PCR grundsätzlich durch zwei verschiedene Enzyme realisiert: einer reversen Transkriptase und einer PCR-fähigen DNA-Polymerase. Allerdings ist die Hitzeinstabilität von retroviralen reversen Transkriptasen ein großer Nachteil.[143] Der Einsatz einer thermostabilen DNA–abhängigen DNA-Polymerase mit der Fähigkeit zur reversen Transkription würde daher die Anwendung in RT-PCR bei hohen Temperaturen ermöglichen. Hohe Temperaturen verringern die Ausbildung von Sekundärstrukturen der RNA,[142] fördern die Spezifität[142] und würden im Allgemeinen die Verwendung von zwei Enzymen unnötig machen. Dadurch würden Probleme, wie der inhibitorische Effekt zwischen einer reversen Transkriptase und einer DNA-Polymerase eliminiert werden.[152-154] Darüber hinaus könnte ein zusätzlicher RT-Schritt, notwendig für die reverse Transkriptase, ausgelassen werden, was eine Arbeits- und Zeitersparnis zur Folge hätte.


Zu diesem Zweck wurden zwei KlenTaq (KTq)-Varianten M1 (L322M, L459M, S515R, I638F, S739G, E773G) und M747K über DNA-Shuffling kombiniert, um eine Enzymbibliothek mit allen möglichen Mutationskombinationen zu erhalten. Der Literatur zufolge besitzen beide Enzyme eine gewisse reverse Transkriptase-Aktivität,[148] wie auch die Fähigkeit DNA-Schäden zu überlesen[159]. Die Durchmusterung der entstandenen Varianten-Bibliothek, bezüglich PCR- und reverser Transkriptase-Aktivität, ergab Enzymmutanten mit Eigenschaften, die die Aktivitäten der parentalen Enzyme bei weitem übertrafen. Die Sequenzierung und funktionelle Charakterisierung der vielversprechendsten Varianten deutete darauf hin, dass vier Mutationen (L459M, S515R, I638F, M747K) für den beobachteten Anstieg der reversen Transkriptase-Aktivität wichtig sind. Während das Fehlen der L459M-Mutation in einer Variante einen Verlust an Gesamtaktivität zur Folge hatte, führten zusätzliche Mutationen zu keinem Gewinn an reverser Transkriptase-Aktivität. Zusammenfassend kann gesagt werden, dass eine neue Generation von KlenTaq-Varianten entwickelt werden konnte, die gegenüber der parentalen Variante KTq M1 eine bis zu 20-fach, und gegenüber KTq M747K eine bis zu 100-fach, erhöhte reverse Transkriptase-Aktivität aufweist. Die Ergebnisse deuten auf einen unerwarteten synergistischen Effekt der Mutationen hin. Weitere RT-PCR Experimente mit den gereinigten Enzymen bestätigten die überlegene reverse Transkriptase-Aktivität der gefundenen Varianten. RT-KTq 2, die die vier vielversprechendsten Mutationen (L459M, S515R, I638F, M747K) aufweist, wurde in weiteren Experimenten untersucht. Das Enzym wurde erfolgreich in TaqMan basierter Echtzeit-RT-PCR eingesetzt und ermöglichte die schnelle Detektion von Influenza Viren A und B.
Das Enzym ermöglicht den Einsatz in schneller RT-PCR, da ein RT-Schritt nicht notwendig ist und vorhergehende Reaktionsoptimierungen für eine reverse Transkriptase und DNA-Polymerase überflüssig sind. Die RT-PCR wiederum ist essentiell für z.B. wichtige Bereiche der klinischen Diagnostik, wie der patientennahen Labordiagnostik (POCT). Das thermostabile Enzym erlaubt weiterhin die RT-PCR bei hohen Temperaturen durchzuführen, die die unspezifische Bindung von Primern und die Bildung von Sekundärstrukturen der RNA verhindern. Die Volllängenenzyme der Varianten zeigten darüber hinaus vielversprechende Eigenschaften, die den Einsatz in TaqMan basierter RT-PCR realisieren.


Momentan sind nur wenige thermostabile Enzyme kommerziell erhältlich,[147, 151] die in der Lage sind, sowohl revers zu transkribieren als auch DNA zu amplifizieren. Dies liegt wahrscheinlich auch an dem Mangel an Kenntnissen bezüglich des Mechanismus den DNA-Polymerasen nutzen, um zwischen den Nukleinsäuretemplaten DNA und RNA zu diskriminieren. Daher ist es schwierig solche DNA-Polymerasen rational zu entwickeln. Dieser Mangel an Wissen resultiert vermutlich daraus, dass von DNA-abhängigen DNA-Polymerasen, deren Wildtyp-Vorläufer keine signifikante reverse Transkriptase-Aktivität aufweisen, keine strukturellen Daten vorliegen, die zeigen wie diese Enzyme RNA prozessieren. Daher setzten wir es uns als Ziel die KlenTaq DNA-Polymerase im Komplex mit RNA als Templat zu kristallisieren, um Einblicke zu gewinnen, wie DNA-abhängige DNA-Polymerasen zwischen den verschiedenen Nukleinsäuretemplaten unterscheiden können.


Obwohl es uns nicht gelang KlenTaq-Wildtyp in Komplex mit einem DNA/RNA-Hybriden zu kristallisieren, konnten wir Kristalle der RT-KTq 2 Variante, sowohl in Komplex mit einem DNA/DNA-Duplex als auch mit einem DNA/RNA-Hybrid-Duplex, erhalten und deren Struktur lösen. Die Kristallstruktur erlaubte zum ersten Mal Einblicke, wie eine DNA-abhängige DNA-Polymerase RNA prozessiert. Zusammen mit Dipl.-Biol. Konrad Bergen gelang es, die wichtige Rolle der Enzymmutationen zu identifizieren, die es der Mutante erlauben die unterschiedliche Geometrie des Hybrid-Duplexes zu akzeptieren und dadurch RNA als Templat effizient zu prozessieren.


Die L459M Mutation trägt dazu bei, dass eine Kollision der Daumendomäne mit dem Hybrid-Duplex verhindert wird und ermöglicht gleichzeitig dass ein Nukleotidbindemotiv in der Daumendomäne ihre Interaktionen mit dem Nukeinsäureduplex beibehält. Darüber hinaus stabilisiert die S515R Mutation dieses Motiv durch Interaktionen mit umgebenden Aminosäureresten. Während die Rolle der I638F Mutation schwer vorherzusagen ist, vermuten wir, dass die M747K Mutation die positive Oberflächenladung in der Nähe des negativ geladenen Substratrückgrats erhöht. Eine daraus folgende, erhöhte elektrostatische Interaktion könnte die Bindung des Nukleinsäurerückgrats erleichtern und dadurch die Fähigkeit, ungewöhnliche Substrate zu akzeptieren, fördern.
Ein letzter Gesichtspunkt der vorliegenden Arbeit befasst sich mit dem erweiterten Substratspektrum der neuen KlenTaq-Varianten. Die Anwendungsmöglichkeiten scheinen vielseitig zu sein. Mit ihrer erhöhten Eigenschaft DNA-Läsionen zu überlesen, wären sie nützliche Werkzeuge in paläontologischen, archäologischen oder forensischen Studien in denen geschädigte DNA in PCR-Reaktionen prozessiert werden muss.[217] Die hohe Fehlerrate, kombiniert mit der Fähigkeit DNA in PCR zu amplifizieren, würde es erlauben Mutationen in Gene einzuführen, was z.B. Anwendung in der gerichteten Enzymevolution finden würde.[122]



Diese Arbeit bestand aus zwei großen Studien, die beide das Ziel hatten, die DNA-Synthese, katalysiert durch die KlenTaq DNA Polymerase, ausgehend von zwei ungewöhnlichen Substraten zu untersuchen: die DNA-Synthese ausgehend von abasischen Stellen enthaltenden Templaten und RNA.


Beide Studien geben Einblicke in die Natur der Templatprozessierung durch DNA-Polymerasen: Allgemein ist zu sagen, dass diese Enzyme eine gewisse Flexibilität besitzen, um sich an ungewöhnliche Substrate anzupassen. Diese Flexibilität kann durch gerichtete Enzymevolution verändert oder sogar erhöht werden. Detailliert betrachtet, übernimmt eine Aminosäure im Überlesen abasischer Stellen die Rolle der Nukleobase im Templat, wodurch bevorzugt Purine eingebaut werden. Die Mutation dieser Aminosäure verhinderte nicht den Bypass der abasischen Stelle durch das Enzym, sondern veränderte nur das Bypass-Verhalten hin zu einer Präferenz von Pyrimidinen. Zusätzlich konnten Mutationen in das Wildtyp-Enzym eingebracht werden, die die Prozessierung von RNA als Templat erhöhen. Die schwache intrinsische Bindung und Prozessierung des nicht-natürlichen Substrats RNA wurden durch gerichtete Enzymevolution verbessert und hatte eine höhere reverse Transkriptase-Aktivität des Enzyms zur Folge.


In dieser Arbeit ermöglichte die gerichtete Enzymevolution auch das Untersuchen von biologischen Prozessen und Mechanismen. Die Mutation der Tyrosinseitenkette zu Tryptophan bestätigte das beschriebene Modell der „A-rule“. Darüber hinaus erlaubte die Evolution einer KlenTaq DNA-Polymerase Mutante, mit der Fähigkeit RNA-Template zu prozessieren, Einblicke in die Einschränkungen, die der Wildtyp besitzt, und die vermutlich verantwortlich für die Diskriminierung zwischen RNA und DNA sind.
Durch gerichtete Enzymevolution konnten daher Einblicke in die der DNA-Synthese zu Grunde liegende Prinzipien erhalten werden.