One of the hallmarks of chronic obstructive pulmonary disease (COPD) is chronic systemic and local inflammation of the lung. A majority of COPD patients show insensitivity to inhaled corticosteroids, which are usually very effective drugs for the treatment of chronic lung inflammation. Expression of inducible NO synthase (iNOS) has been shown in the lung epithelial, inflammatory and skeletal muscle cells of COPD patients and correlates well with increased NO and peroxynitrite (ONOO-) production, leading to increased nitrative stress and amplified inflammation in COPD. iNOS inhibitors have been shown to potently block inflammation in a tobacco smoke-induced steroid-insensitive mouse model of COPD. Furthermore, iNOS and iNOS-derived NO and ONOO- has been hypothesized to be involved in steroid insensitivity through tyrosine nitration of histone deacetylase 2 (HDAC2), as the anti-inflammatory action of corticosteroids works, at least partially, via HDAC-mediated histone deacetylation and reduction of the inflammatory gene transcription. In contrast, HDAC inhibition by HDAC inhibitors revealed potent anti-inflammatory effects in a wide variety of animal and cell models, which suggests an even more complex situation.


The objectives of the present study were i) to characterize several human lung epithelial cell models including A549, BEAS-2B and MucilAir cells for their applicability to study lung inflammation in vitro; ii) to evaluate iNOS mRNA expression and NO production in the human lung epithelial cell line A549 and to study the anti-inflammatory effects of specific iNOS inhibitors in these cell models; iii) to identify an iNOS expressing lung epithelial cell model of steroid insensitivity and to test the hypothesis that iNOS is involved in steroid insensitivity by modulating iNOS activity and expression as well as NO/ONOO- level; iv) to analyze a putative connection between steroid sensitivity of cytokine release and HDAC inhibition; v) to explore the functional effects of HDAC inhibitors in lung epithelial cell models of inflammation by assessing release and gene expression of pro-inflammatory cytokines and chemokines, and elucidating histone hyperacetylation at IL-8 promoter region.


Initially, stimulation of human lung epithelial cells using various cytokine stimuli such as IL-1beta and TNF-alpha induced the production and mRNA expression of amounts of pro-inflammatory cytokines and chemokines substantially, suggesting the critical role of lung epithelial cells in lung injury and also in regulating the inflammatory responses together with immune cells in the lung.


Previously, potent inhibitory effects of several iNOS inhibitors on inflammatory cell influx (neutrophils, alveolar macrophages and T lymphocytes) into the lung and accumulation of various cytokines and chemokines [MIP-1alpha, MCP-1 and KC (IL-8 homologue)] in BALF (bronchoalveolar lavage fluid) were shown using a clinically relevant tobacco smoke mouse model of COPD. With the intention to elucidate these anti-inflammatory effects of selective iNOS inhibitors in lung epithelial cells, iNOS expression and NO production by A549 cells in response to different cytokine stimuli were characterized. The combination of IL-1beta, TNF-alpha and IFN-gamma as cytokine-mix (CM) upregulated iNOS mRNA expression and iNOS-derived NO production in A549 cells substantially and dsRNA further enhanced this induction. We could show that highly selective and potent iNOS inhibitor BYK191023 inhibited IL-8 release and gene expression in CM-stimulated A549 cells. This effect was verified by BYK402750, another selective iNOS inhibitor, by reducing release of various cytokines and chemokines in CM-stimulated lung epithelial cell line BEAS-2B and primary lung epithelial cells MucilAir.


Subsequently, a cellular model of steroid insensitivity of IL-8 release using cytokine mix (CM) stimulated A549 cells was established and characterized. CM-stimulated A549 cells showed steroid insensitivity and concomitantly expressed iNOS. They also demonstrated reduction of HDAC activity upon exposure to exogenous nitrative and oxidative stress caused by SIN-1 and H2O2. Using multiple analyte profiling (Luminex) steroid insensitivity of cytokine release was shown for a wide variety of cytokines and chemokines, including GM-CSF and IL-2R. However, modulating iNOS or the level of NO/ONOO- did not affect steroid responsiveness of cytokine release, neither by using selective iNOS inhibitors or iNOS overexpression nor by usage of the NO/ONOO- donor SIN-1 in presence or absence of H2O2. Additionally, steroid sensitivity in BEAS-2B cells and in MucilAir cells was analyzed using identical conditions and preliminary data suggested steroid-insensitive responses of IL-6, IL-8 and GM-CSF release in primary lung epithelial cells but not in BEAS-2B cells. Thus, iNOS does not seem to play a role in steroid insensitivity, at least in the CM-stimulated A549 cell model used.


Furthermore, the dexamethasone-mediated anti-inflammatory effects on cytokine release were not changed by HDAC inhibition in lung epithelial cells by addition of various HDAC inhibitors, again suggesting an HDAC independent mode of action of steroid under the conditions used.


Studying functional effects of HDAC inhibitors on pro-inflammatory mediator release and mRNA expression in cytokine-stimulated human lung epithelial cells indicated that HDAC inhibitors can act both anti- and pro-inflammatory depending on the HDAC inhibitor used, on the cell type (primary cells vs. cancer cell line) and on the target gene, which may suggest different target gene/promoter-specific mode of action of HDAC inhibitors. For some of the cytokines and chemokines studied, this effect was partially regulated at the level of mRNA expression, which may involve the induction of histone H3 hyperacetylation at the IL-8 promoter.


In conclusion, the present study demonstrated that iNOS inhibitors show anti-inflammatory effects on the release of specific cytokines and chemokines in human lung epithelial cells, which may help to define the rationale for the development of potent iNOS inhibitors for the treatment of lung inflammation. Nevertheless, our results suggest that iNOS does not influence steroid sensitivity, at least in the cell model used, and that steroid sensitivity of cytokine release in cell model used may be independent of HDAC activity. Moreover, HDAC inhibition revealed both pro- or anti-inflammatory effects, depending on the HDAC inhibitors studied and gene targeted. The induction of histone H3 hyperacetylation at the promoter of IL-8 gene may help to explain the mode of action of SAHA in its functional effects in inflammation.

Zu den wichtigsten Kennzeichen der chronisch obstruktiven Lungenerkrankung (COPD) zählt neben einer systemischen Inflammation auch eine lokale Entzündung des Lungengewebes. Darüber hinaus zeigt eine Mehrheit der COPD-Patienten eine Insensitivität gegenüber einer Behandlung mit Corticosteroiden, welche üblicherweise eine sehr wirksame medikamentöse Therapie zur Behandlung von entzündlichen Erkrankungen wie z. B. Asthma darstellen. Die molekularen und zellbiologischen Grundlagen dieser Steroidinsensitivität werden momentan weltweit untersucht. Erste Ergebnisse verschiedener Gruppen zeigen dabei eine wichtige Rolle von oxidativen und nitrativen Stress, sowie der Histondeacetylierung. Eine gesteigerten Produktion von Stickstoffmonoxid (NO) und Peroxynitrit (ONOO-), welche zu erhöhtem nitrativen Stress und verstärkter Inflammation in der COPD führen kann, wurde zusammen mit einer verstärkten Expression der induzierbaren NO Synthase (iNOS) bereits in Lungenepithelzellen, inflammatorischen Zellen und Skelettmuskelzellen von COPD-Patienten nachgewiesen. Darüber hinaus konnte bereits eine gute Wirksamkeit von iNOS-Inhibitoren in einem Zigarettenrauch-induzierten steroid-insensitiven Maus-Modell der COPD gezeigt werden. In diesem Zusammenhang wurde die Hypothese aufgestellt, dass iNOS und durch iNOS produziertes NO und ONOO- die Steroid-Insensitivität durch Tyrosinnitrierung der Histone Deacetylase 2 (HDAC2) vermitteln kann, wobei die anti-inflammatorische Wirkung von Steroiden auf eine Interaktion mit Histondeacetylasen (HDAC), welche die Transkription inflammatorischer Gene durch Histondeacetylierung hemmt, zurückzuführen ist. Im Gegensatz dazu konnte gezeigt werden, dass HDAC- Inhibitoren in vielen in vivo und in vitro Modellen anti-inflammatorische Wirkung besitzen.


Die Ziele der vorliegenden Arbeit waren: I) Charakterisierung der Lungenepithelzelllinien A549 und BEAS-2B und der primären bronchialen Lungenepithelzellen MucilAir bezüglich ihrer pro-inflammatorischen Funktionalität in vitro; II) Ermittlung der iNOS-Expression und NO-Produktion in A549 Zellen und Untersuchung der anti-inflammatorischen Wirkung von iNOS-Inhibitoren in humanen Lungenepithelzellen; III) Identifizierung eines iNOS-exprimierenden und steroid-insensitiven Lungenepithelzell-Modells und Überprüfung der Hypothese zur iNOS-Beteiligung an der Steroidinsensitivität in diesem Zellmodell durch Modulation der iNOS-Aktivität und der NO-Produktion in diesen Zellen; IV) Untersuchung des Zusammenhangs zwischen der Steroidsensitivität der Zytokinfreisetzung und der HDAC-Inhibition mit Hilfe unterschiedlich selektiver HDAC-Inhibitoren; V) Erforschung der funktionellen Effekte von HDAC-Inhibitoren in Lungenepithelzell-Modellen auf die Freisetzung sowie die mRNA-Expression inflammatorischen Zytokine und durch Bestimmung der Histon-Hyperacetylierung im IL-8 Promotorenbereich.


Erste Experimente zeigten, dass die Stimulation der Lungenepithelzellen mittels verschiedener Zytokine wie IL-1beta und TNF-alpha die mRNA-Expression und Freisetzung von vielen pro-inflammatorischen Zytokinen und Chemokinen induzierte, was eine wichtige Funktion der Lungenepithelzellen im Zusammenhang mit inflammatorischen Reaktionen der Lunge bestätigte.


In unseren früheren Studien in einem klinisch relevanten Zigarettenrauch-induziertem Maus-Modell der COPD, konnten wir zeigen, dass hochselektive iNOS-Inhibitoren sowohl die Rekrutierung inflammatorischen Zellen (Neutrophile, Makrophagen und T-Lymphozyten) als auch die Produktion pro-inflammatorischer Zytokine und Chemokine [MIP-1alpha, MCP-1 und KC (einem IL-8 Analog)] in der Lunge hemmen. Um nun die anti-inflammatorische Wirkung der iNOS-Inhibitoren in vitro näher zu bestimmen, wurde zunächst die iNOS mRNA-Expression und die NO-Produktion in zytokin-stimulierten A549 Zellen charakterisiert. Eine Kombination von IL-1beta, TNF-alpha und IFN-gamma (als Zytokin-Mix CM bezeichnet) konnte die iNOS mRNA-Expression und die NO-Produktion stark hochregulieren, wobei der Zusatz von dsRNA zu diesem Zytokin-Mix die iNOS-Induktion wesentlich verstärkte.


Im Folgenden wurden diese CM-stimulierten und iNOS-exprimierenden A549 Zellen als Zellmodell für die weitere Untersuchung der iNOS-Funktion in Inflammation und Steroid-Insensitivität benutzt. Dabei konnte gezeigt werden, dass die Freisetzung und mRNA-Expression von IL-8 durch den hochselektiven iNOS-Inhibitor BYK191023 gehemmt wurde. Dieser Effekt von iNOS-Inhibitoren auf die Freisetzung weiterer pro-inflammatorischen Zytokinen und Chemokinen konnte in der zytokin-stimulierten Zelllinie BEAS-2B und den primären Lungenepithelzellen MucilAir mittels Luminex Assay weiter bestätigt werden.

Im Anschluß wurde ein steroid-insensitives Zellmodel von CM-stimulierten A549 Zellen anhand der Freisetzung und mRNA-Expression von IL-8 etabliert und charakterisiert. Mittels Luminex Assay wurde die Steroid-Insensitivität der Zytokin-Freisetzung in A549 Zellen bezüglich verschiedener Zytokine und Chemokine überprüft, wobei die Freisetzung von GM-CSF und IL-2R als steroid-insensitiv dargestellt werden konnte. Da dieses Zellmodell darüber hinaus sowohl eine iNOS-Expression als auch eine Reduktion der HDAC-Aktivität gegenüber oxidativen und nitrativen Stress zeigte, erfüllte es die Bedingungen für die Überprüfung der Hypothese der iNOS-Beteiligung an der durch HDAC-Aktivitätsreduktion verursachten Steroid-Insensitivität. Entgegen der Hypothese hatte jedoch die iNOS-Modulation durch iNOS-Inhibitoren keinen Einfluss auf die Steroid-Insensitivität. Außerdem beeinflusste weder eine iNOS-Überexpression noch der Zusatz des NO/ONOO- -Donors SIN-1 (mit/ohne H2O2) in IL-1beta-stimulierten A549 Zellen die Steroid-Sensitivität der IL-8-Freisetzung. Daraufhin wurde die Steroid-Sensitivität von BEAS-2B und MucilAir Zellen unter ähnlichen Bedingungen wie in A549 Zellen analysiert. Dabei konnte eine Steroid-Insensitivität der IL-6, IL-8 und GM-CSF-Freisetzung in MucilAir Zellen, nicht aber in BEAS-2B Zellen gezeigt werden.


Schliesslich wurde der Zusammenhang zwischen einem steroid-vermittelten, anti-inflammatorischen Effekt auf die Zytokin-Freisetzung und der HDAC-Aktivität in zytokin-stimulierten Lungenepithelzellen untersucht. Wir konnten zeigen, dass die Steroid-Sensitivität der Zytokin-Freisetzung durch die Behandlung der Zellen mit verschiedenen HDAC-Inhibitoren nicht beeinflusst wurde. Dies deutet auf eine HDAC-unabhängige Wirkungsweise von Steroiden unter den verwendeten experimentellen Bedingungen hin.


Im Anschluss wurden funktionelle Effekte von HDAC-Inhibitoren auf zytokin-stimulierte Lungenepithelzellen untersucht. Hier konnten sowohl induzierende als auch inhibierende Wirkungsweisen auf die Freisetzung und mRNA-Expression verschiedener pro-inflammatorischer Zytokine und Chemokine gezeigt werden, wobei die Effekte abhängig vom verwendeten Zelltypus waren (primäre Zellen vs Zelllinien), sowie von den verwendeten HDAC-Inhibitoren und untersuchten Zielgenen. Letzteres würde ein promotor-spezifischer Wirkmechanismus erklären.


Andererseits konnten die inhibitorischen Effekte der HDAC-Inhibitoren SAHA und TSA auf die IL-1beta-induzierte IL-8- und GM-CSF-Freisetzung nicht in jedem Fall mit einer Inhibition der jeweiligen mRNA-Expression korreliert werden, was auf differenzielle Wirkmechanismen für unterschiedliche Zytokine hindeutet.


Schlussfolgernd legt die vorliegende Arbeit dar, dass selektive iNOS-Inhibitoren anti-inflammatorische Effekte auf die Freisetzung von spezifischen Zytokinen und Chemokinen in humanen Lungenepithelzellen zeigen. Dies könnte zur Entwicklung von wirksamen iNOS-Inhibitoren zur Therapie von COPD beitragen. Andererseits konnte keine Beeinflussung der Steroid-Sensitivität der Freisetzung von pro-inflammatorischen Zytokinen durch iNOS und durch iNOS produziertes NO gezeigt werden, welche darüber hinaus auch unabhängig von einer HDAC-Inhibierung war. Im Gegensatz dazu führte eine HDAC-Inhibition sowohl zu anti- als auch zu pro-inflammatorischen Effekten auf die Freisetzung und mRNA-Expression von Zytokinen und Chemokinen, abhängig vom Zelltypus, HDAC-Inhibitor und untersuchtem Zielgen, was eine komplexe, nicht ausschliesslich transkriptionelle Regulation inflammatorischer Vorgänge durch Histondeacetylasen vermuten lässt.