This work was initiated by the observation that treatment with PN inhibits PGIS with a concomitant appearance of a protein band that positively reacts with an antibody against NT. This study has confirmed tyrosine nitration of PGIS as the underlying mechanism of enzyme inhibition and has provided evidence for a broad physiological and pathophysiological significance of this new posttranslational protein modification. Our results focus on superoxide as a messenger, which combines with NO to exert tyrosine nitration. It turned out that the important process of endothelial activation is primarily based on superoxide generation, which can be mediated by xanthine oxidase (endotoxin), NADPH-oxidase (hyperglycemia/ diabetes), mitochondria (aging) or NO-synthase - oxidase (still under debate, e.g. aging). The results of this study are discussed under the aspects of
1.) chemistry and biochemistry of PGIS nitration
2.) superoxide as a messenger and
3.) endothelial cell activation type I

The most important results are summarized as follows:

1. Nitration of prostacyclin synthase
· For this study two reliable and sensitive methods for the detection of nitrated PGIS and nitration in general have been established: The immunoprecipitation of nitrated PGIS and the total hydrolysis of microsomes and homogenates followed by HPLC analysis.
· Both methods in combination with MALDI-TOF mass spectroscopy, confirmed PGIS nitration by peroxynitrite.
· The applied methods confirm a high proteolytic stability of PGIS
· Increased PGIS nitration was observed in different model systems, like hypoxia-reoxygenation, hyperglycemia and endotoxemia.

2. Superoxide as a messenger
· Our results demonstrate that superoxide in combination with NO generates peroxynitrite, which serves as a highly reactive derivate of the superoxide radical in the cellular system.
· In the very early stage of inflammation in coronary arteries, xanthine oxidase was identified as major superoxide source.
· In the aging process, mitochondria mainly contributed to the superoxide generation, partially caused by the reduction of functionally Mn-SOD
· The superoxide generation under hyperglycaemic conditions was caused by the induction of NADPH-oxidase and further via the activation of the PKC cascade.

3. Endothelial cell activation Type I
· This work confirms, that different endogenous superoxide sources can lead into Phase 1 of endothelial cell activation (ECA-I) and therefore modulate endothelial function.
· Endothelial properties are inverted within the first hour of superoxide formation, without affecting gene or protein expression.
· The reaction of superoxide with NO leads to increased peroxynitrite generation, which nitrates and inactivates PGIS, thus strongly attenuating the two important signalling molecules NO and prostacyclin, which are essential for vascular homeostasis. In contrast, the substrate of PGIS, PGH2, with its vasoconstricting properties accumulates and therefore the balance of endothelial mediators is shifted towards vasoconstriction.

Diese Arbeit wurde durch die Beobachtung initiiert, dass sich die Prostacyclin
Synthase durch Peroxynitrit hemmen läst und mit dem Auftreten einer Nitrierung
einhergeht. Die vorliegende Studie bestätigt die Tyrosin-Nitrierung der Prostacyclin Synthase als zugrundeliegenden Mechanismus für die Enzymhemmung und liefertzahlreiche Hinweise für die physiologische und pathophysiologische Bedeutung als posttranslationale Modifikation. Unsere Befunde konzentrieren sich auf die Signalmolekülfunktion von Superoxid, welches nach der Kombination mit NO zur Nitrierung von speziell exponierten Tyrosinen führt. Es stellte sich heraus, dass der Prozess der endothelialen Aktivierung hauptsächlich auf der Bildung von Superoxid beruht, welches von der Xanthin-Oxidase (Entzündung), NADPH-Oxidase (Hyperglykämie/ Diabetes), den Mitochondrien (Alterung) oder der NO-Synthase-Oxidase (wird für die Alterung noch debattiert) stammt. Die Resultate dieser Studie wurden diskutiert unter dem Aspekt der:
1. Chemie und Biochemie der Tyrosin-Nitrierung in der Prostacyclin-Synthase
(PGIS)
2. Bedeutung von Superoxid als Signalmolekül
3. Rolle von Peroxynitrite bei der endothelialen Zellaktivierung

Die wichtigsten Ergebnisse sind im Folgenden zusammengefasst:
1. Nitrierung der Prostacyclin Synthase
Für diese Studie wurden zwei zuverlässige und empfindliche
Methoden für den Nachweis der PGIS-Nitrierung und Nitrierung im
allgemeinen etabliert. Zum einen die Immunoprezipitation der
nitrierten PGIS und zum anderen die Totalhydrolyse von Homogenaten
mit nachfolgender HPLC-Analyse.
Beide Methoden in Verbindung mit MALDI-TOF
Massenspektroskopie, bestätigten die durch Peroxynitrit
hervorgerufene Nitrierung der PGIS. Die angewandte Methodik bestätigte eine hohe Stabilität der PGIS
gegenüber proteolytischer Zersetzung und Denaturierung.
Erhöhte Nitrierung der PGIS konnte in einigen Modelsystemen, wie
zum Beispiel Hypoxie-Reoxygenierung, Hyperglykämie und
Endotoxämie nachgewiesen werden.

2. Superoxid als Signalmolekül
Unsere Resultate zeigen, dass Superoxid in Verbindung mit NO
Peroxynitrit bildet, welches als höchst reaktive Form des Superoxid-
Radikals in zellulären Systemen fungiert.
Im frühen Stadium der Entzündung in bovinen Koronargefäßen,
konnte die Xanthin-Oxidase als maßgebliche Superoxid-Quelle
identifiziert werden.
Am Alterungsprozess der Blutgefäße sind die Mitochondrien ein
entscheidender Bildungsort für Superoxid, zum Teil bedingt durch die
Reduktion von funktioneller Mn-SOD.
Die Superoxid-Generierung in der Hyperglykämie/ Diabetes wird
durch die Induktion der NADPH-Oxidase und über ihre Aktivierung
durch die Protein Kinase C verursacht.

3. Die Aktivierung der Endothelzelle - Typ I
Diese Arbeit belegt, dass verschiedene endogene Superoxid-Quellen
zur 1. Phase in der Endothelzellaktivierung führen können und damit
die Funktion des Endothels modulieren.
Erhöhte vaskuläre Superoxid-Spiegel invertieren innerhalb einer
Stunde die endothelialen Eigenschaften, ohne dabei die Gen- bzw.
Proteinexpression zu verändern.
Die gesteigerte Superoxid-Freisetzung führt nach der Reaktion mit NO
zur gesteigerten Peroxynitrit Bildung, welches die PGIS nitriert und
inaktiviert. Dadurch werden die zwei wichtigen Signalmoleküle NO
und PGI2, die zum Erhalt der vaskulären Homöostase unerlässlich sind,stark reduziert. Im Gegenzug akkumuliert das Substrat der PGIS,
Prostaglandin Endoperoxid H2, welches vasokonstriktorische
Eigenschaften über seine Aktivierung des TP-Rezeptors besitzt.
Dadurch wird das Gleichgewicht der endothelialen Mediatoren
zugunsten der Vasokonstriktion verschoben.