Charakterisierung der biochemischen und biologischen Funktionen von Polyubiquitinketten
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Die Konjugation mit Ubiquitin ist eine wichtige posttranslationale Modifikation in fast allen zellulären Signalwegen. Neben den gut untersuchten K48-Ubiquitinketten, die das Substratprotein zum proteasomalen Abbau markieren, bilden anders verknüpfte Ubiquitinketten Signale, welche das Zielprotein für unterschiedlichste Schicksale bestimmt. In dieser Arbeit wurde eine Methode etabliert, homogene Ubiquitinketten chemisch sowie enzymatisch herzustellen. Zusätzlich wurde mithilfe dieser Ubiquitinketten eine Reihe von Pulldown-Experimenten durchgeführt, um neue kettenspezifische Interaktionspartner zu isolieren. Die Funktionalität dieser Methode wurde durch die Isolation von bereits bekannten Ubiquitinrezeptoren bestätigt; neue Interaktionspartner konnten dagegen nicht gefunden werden.
Weiterhin wurde die ektopische Überexpression von Ubiquitin im Zellkultursystem näher untersucht. Dabei konnte gezeigt werden, dass sich diese negativ auf die Proteolyse einiger untersuchter Proteine auswirkte (p53, UbiquitinG76VGFP). Dieser unerwartete Effekt wurde genauer charakterisiert, wobei es starke Hinweise auf die Inhibition eines Ubiquitinrezeptors im Abbauweg dieser Proteine gibt.
Desweiteren wurde die Rolle des Ubiquitinrezeptors Rad23 im Zusammenspiel mit dem deubiquitinierenden Enzyms UBP1 in der Entstehung spezifischer Ubiquitinketten untersucht. Hier konnte gezeigt werden, dass Rad23, welches selektiv K48-Ubiquitinketten bindet, diese vor der Deassemblierung durch das DUB UBP1 schützen kann. Die Ergebnisse wurden unter Einsatz von Ubiquitinmutanten erhalten und konnten bisher nicht in einem experimentellen Aufbau mit Wildtyp-Ubiquitin bestätigt werden.
Im letzten Teil dieser Arbeit wurde die allosterische Aktivierung des E2s UbcH5b durch die RING-Domäne von Mdm2 untersucht. Im Zuge dessen wurden Mutanten der RING-Domäne von MdmX (CV und NoLS) in ihrer erworbenen E3 Ligase Aktivität untersucht. Aus den in diesem Teil gewonnen Daten können Schlüsse gezogen werden, dass sie eher in ihrer Multimerisierung als in ihrer E2-Bindung verändert sind. Außerdem wurde gezeigt, dass die Aminosäurereste der NoLS einen Beitrag zur E3 Ligase Aktivität von Mdm2 leisten.
Zusammenfassung in einer weiteren Sprache
The conjugation with ubiquitin is an important posttranslational modification in almost every cellular pathway. Apart from the well described K48-ubiquitin chains, which target the substrate protein for proteasomal degradation, differently linked ubiquitin chains serve as non-degradative signals for a variety of fates. In the present work, a technique could be established to synthesize homogeneous ubiquitin chains, chemically as well as enzymatically. Additionally, with the help of this technique, a series of pulldown experiments were performed in order to isolate unknown linkage-specific interaction partners. The general functionality of this technique could be demonstrated by the isolation of well known ubiquitin receptors; whereas new interaction partners could not be identified.
Furthermore, the ectopic overexpression of ubiquitin was analyzed in our cell culture systems. Thereby a negative effect on the proteolysis of most of the examined proteins (p53, ubiquitinG76VGFP) after ubiquitin overexpression could be shown. This unexpected effect was characterized in detail whereupon the inhibition of a so far unknown ubiquitin receptor by the ectopically expressed ubiquitin in the degradation pathway of these proteins seems most likely.
In addition, the role of the ubiquitin receptor Rad23 in the interplay with the deubiquitinating enzyme UBP1 was studied in the context of ubiquitin chain formation. Here it was demonstrated, that the K48-selective ubiquitin receptor Rad23 is able to protect this type of chains selectively from the action of the DUB UBP1. These results were obtained using ubiquitin mutants and could not be verified using wildtype ubiquitin so far.
In the last part of the present study, the allosteric activation of the E2 UbcH5b by the RING-domain of Mdm2 was examined. On top of that, RING-domain mutants of MdmX (CV and NoLS) were studied regarding their gain of function as E3 ligases. They rather seem to be altered in their oligomerization than in their binding abilities toward the E2. Furthermore it was shown that the amino acids forming the NoLS contribute to the E3 ligase activity of Mdm2.
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ISO 690
WOLLSCHEID, Hans-Peter, 2009. Charakterisierung der biochemischen und biologischen Funktionen von Polyubiquitinketten [Dissertation]. Konstanz: University of KonstanzBibTex
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