Apoptose als eine im Gegensatz zur Nekrose kontrollierte Form des Zelltodes spielt eine zentrale Rolle in der Embryonalentwicklung, der Organ-Homöostase und zahlreichen Erkrankungen. Die Zytokine Tumor-Nekrose-Faktor (TNF), CD95-Ligand (CD95L) und TRAIL lösen durch Bindung an den jeweiligen Rezeptor in dafür empfänglichen (sensiblen) bzw. sensitivierten Zellen eine hierarchisch gegliederte, kontrollierte Kaskade von proteolytischen Prozessen aus. Die Proteasen, die für diese Prozesse und für die daraus resultierende Apoptose verantwortlich sind, sind die sog. Caspasen, eine Familie von zytosolischen, Aspartat-spezifischen Cysteinproteasen.
Da eine stetig steigende Zahl von Studien nahe legt, dass neben den Caspasen auch andere Proteasen eine wichtige Rolle in der Apoptose spielen, war es das Ziel der vorliegenden Untersuchung, die Beteiligung dieser Proteasen am apoptotischen Zelltod der humanen Hepatom-Zelllinie HepG2 zu untersuchen. Im speziellen wurde die Rolle der lysosomalen Cysteinprotease Cathepsin B während der Camptothecin- bzw. Actinomycin D(ActD)/TNF-induzierten Apoptose untersucht. Darüber hinaus sollte in sensitivierten HepG2-Zellen die Beteiligung von Caspasen und anderen Proteasen an der TNF-, CD95- und TRAIL-vermittelten Apoptose im Detail untersucht werden. Im selben Modell wurde auch untersucht, inwieweit diverse pharmakologische Wirkstoffe den apoptotischen Zelltod sensitivierter Zellen modulieren bzw. selbst Zellen für die Todesrezeptor-vermittelte Apoptose sensitivieren können. Die Ergebnisse dieser Untersuchungen lassen sich wie folgt zusammenfassen:

1. Die Behandlung mit Camptothecin führte zu einer zeitabhängigen Translokation von Cathepsin B aus den Lysosomen ins Zytosol.
2. Die Hemmung von Cathepsin B führte zu einer deutlich verminderten Caspase-Aktivierung. Auch in der ActD/TNF-vermittelten Apoptose war die Caspase-Aktivität nach Inhibition von Cathepsin B signifikant verringert (- 55%). Weder die Inhibition von Cathepsin B noch von Caspasen vermittelte jedoch einen Schutz vor dem apoptotischen Zelltod.
3. Die Behandlung sensitivierter Zellen mit an TNF, CD95 oder TRAIL führte zu einer konzentrations- und zeitabhängigen Caspase-Aktivierung und nachfolgendem Zelltod. Zudem waren Caspase-Aktivität und Zelltod signifikant korreliert (R2 = 0.91, 0.96 und 0.96 für TNF, CD95 bzw. TRAIL), was eine kausale Beteiligung der Caspasen nahe legt.
4. Eine Hemmung der Caspasen durch den Breitband-Inhibitor zVAD-fmk schützte primäre murine Hepatozyten aber nicht HepG2-Zellen vor Todesrezeptor-induzierter Apoptose. In letzteren lässt der Quotient der IC50-Werten für die Hemmung der Caspase-Aktivität bzw. Zytotoxizität (1:812, 1:193 and 1:262 für TNF, CD95 bzw. TRAIL) darauf schliessen, dass der durch zVAD-fmk vermittelte Schutz auf die unspezifische Hemmung eines anderen Faktors oder einer anderen Protease zurück zu führen ist.
5. Der Zelltod unter Caspase-Hemmung war gekennzeichnet durch klassische apoptotische Merkmale wie Zeiose, Chromatin-Verdichtung und Verlust der Zellmembran-Assymetrie. Unterschiede zur Caspase-abhängigen Apoptose bestanden in der Form der Chromatin-Verdichtung und der späten Morphologie. Diese war durch eine distinkte runde Form der abgestorbenen Zellen gekennzeichnet, während aktive Caspasen zu einer völligen Auflösung der Zelle in apoptotische Körperchen führte.
6. Eine Hemmung der Effektor-Caspasen -3 und -7 durch Überexpression ihres endogenen Inhibitors XIAP(?Bir3) vermittelte keinen Schutz in HepG2 Zellen, während hingegen sie in HeLa-Zellen einen signifikanten Schutz vermittelte.
7. Die Freisetzung von Cytochrom c aus den Mitochondrien fand auch in Abwesenheit aktiver Caspasen statt. Unter diesen Bedingungen wurde auch weiterhin eine Spaltung von PARP bzw. der Procaspasen -8 und -9 beobachtet.
8. Der durch den pflanzlichen Wirkstoff Glyzyrrhizin vermittelte Schutz vor Apoptose bzw. die durch den JNK-Inhibitor SP600125 vermittelte verstärkte Apoptose wurde unabhängig davon beobachtet, ob die Caspasen aktiv waren oder gehemmt wurden.
9. Eine Hemmung der Caspasen führte zu einem Umschalten zu einem Serinprotease-abhängigen apoptotischen Zelltod. Ein Schutz vor Todesrezeptor-induzierter Apoptose wurde nur durch gleichzeitige Hemmung von Serinproteasen und Caspasen bewirkt, während die alleinige Hemmung von Caspasen bzw. Serinproteasen nicht protektiv war.
10. Sowohl die Hemmung der c-Jun N-terminalen Kinase (JNK) als auch der Histondeacetylase (HDAC) bewirkte in HepG2-Zellen ohne vorherige Hemmung der Transkription bzw. Translation eine selektive Sensitivierung gegen die CD95- und TRAIL-vermittelte, nicht aber die TNF-vermittelte Apoptose.

Zusammenfassend zeigen die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit, dass eine Hemmung der Caspasen in HepG2-Zellen diese nicht vor dem Zelltod schützt, sondern vielmehr ein Umschalten zu einem neuartigen, Serinprotease-abhängigen apoptotischen Mechanismus bewirkt.

Apoptosis is an essential process in development, organ homeostasis and disease, allowing for cell death in a controlled manner. Death receptor agonists like TNF, CD95L and TRAIL are important mediators of apoptosis as binding to their respective receptors on susceptible cells leads to a series of proteolytical events that finally results in apoptotic death of susceptible cells.
The present study investigated the role of non-caspase proteases in apoptosis of the human hepatoma cell line HepG2. In particular, the role of the lysosomal cysteine protease cathepsin B in DNA damage- and death receptor agonist-induced apoptosis was analyzed. In addition, the role of caspases and non-caspase proteases in cell death induced by the death receptor agonists TNF, agonistic CD95 antibody or TRAIL was studied in detail. Using this model, we also assessed the potential of various drugs to either modulate apoptosis of sensitized cells or sensitize cells to apoptosis induced by death receptor agonists. In summary, the following results were obtained:

1. Camptothecin treatment caused translocation of cathepsin B from the lysosomes to the cytosol in a time-dependent manner.
2. Inhibition of cathepsin B in camptothecin-induced apoptosis lead to a markedly decreased activation of caspases. In accordance, cathepsin B inhibition in apoptosis induced by ActD/TNF caused a significant reduction in caspase activation. However, neither inhibition of cathepsin B nor caspases was able to confer protection from apoptosis.
3. Treatment of sensitized (ActD and CHX, respectively) cells with TNF, agonistic CD95 antibody or TRAIL resulted in concentration- and time-dependent activation of caspases and subsequent cytotoxicity. Moreover, caspase activity and cytotoxicity were significantly correlated (R2 = 0.91, 0.96 and 0.96 for TNF, CD95 and TRAIL, respectively), suggesting a causal role of caspases.
4. Inhibition of caspases by zVAD-fmk was sufficient to protect from death receptor agonist-induced apoptosis in primary murine hepatocytes but not in HepG2 cells. In these, the ratio of IC50 values for inhibition of caspase activity and cytotoxicity (1:812, 1:193 and 1:262 for TNF, CD95 and TRAIL, respectively) suggested that protection by zVAD-fmk was attributable to unspecific inhibition of a non-caspase protease.

5. Cell death after caspase arrest was characterized by classical apoptotic features like zeiosis, chromatin condensation and phosphatidylserine exposure. Differences could be observed for the shape of chromatin condensation which was rather disperse than compacted and the late morphology of cells, which had not disintegrated into apoptotic bodies but rather displayed a distinct round shape.
6. Inhibition of effector caspases-3 and -7 by overexpression of their endogenous inhibitor XIAP(?Bir3) did not confer protection in HepG2 cells, whereas it conferred significant protection in HeLa cells.
7. Caspase arrest did not prevent release of cytochrome c from the mitochondria. Also, cleavage of PARP and procaspases-8 and -9 could be observed in the absence of caspase activity.
8. Protection conferred by the plant compound glycyrrhizin as well as augmented apoptosis by the c-Jun N-terminal kinase inhibitor SP600125 was observed in apoptosis both with and without caspase arrest.
9. Caspase arrest lead to a switch to a serine protease-dependent mechanism of apoptosis which acts upstream of mitochondria. Only combined inhibition of both caspases and serine proteases was able to rescue cells from death receptor agonist-induced apoptosis.
10. Both inhibition of c-Jun N-terminal kinase and histone deacetylase selectively sensitized HepG2 cells to apoptosis induced by CD95 and TRAIL but not TNF, the underlying mechanisms remaining to be elucidated.

In summary, the results of this thesis demonstrate that caspase arrest does not protect HepG2 cells from undergoing cell death but rather causes a switch to a novel, serine-protease dependent mechanism of apoptosis.