Although basic principles promoting laboratory animal welfare were developed almost 50 years ago, only nowadays with better understanding of toxicological mechanisms and new biological technologies tools are at hand to efficiently implement these principles into toxicology.
For most of the important toxicological endpoints in vitro approaches were or are developed. Once a test is developed and is promising, the final step to assess its reliability and relevance is usually a multi-laboratory validation study. However, validation, having proven to be an appropriate tool, still requires optimization and further development.
In the first part of this thesis, the field of evidence-based medicine in clinical diagnostics was identified as a topic closely related to toxicology and validation, whose methodologies are worthwhile to explore and, if indicated to be adapted. Basically two concepts, the prevalence and the imperfectness of the reference standard, were transferred to the field of toxicology. Considering typical toxicological situations, several ways to implement these concepts, especially assessment of toxicological tests, were explored. For example prevalence, a key determinant for the practical value of a diagnostic measure for a disease in clinical diagnostics, was considered in the context of a toxicological health effect, or the impact of the imperfectness of the reference standard, i.e. usually an in vivo experiment, on the prevalence of a toxicological effect was modelled.

Prevalence according to the reference standard was evaluated in detail for the skin irritation potential of chemical substances. Two databases containing in vivo data of the rabbit experiment demanded by regulators were analysed focusing on different prevalence related aspects. The prevalence according to regulatory classification schemes was described in detail, where less than 10% of more than 3000 substances showed irritation potential requiring a hazard label. Analysis of the within-experiment reproducibility of the rabbit experiment revealed that this is only a minor source of variability. The prevalence was combined with the results of the modelling of the within-test variability in order to evaluate the utility of the approach and compare two classification schemes.

A large-scale international validation study for novel pyrogenicity tests focusing on the chosen reference standard was guided with regard to design and biometry and was thoroughly evaluated. In this study six in vitro test based on the human fever reaction were validated against the pharmacopoeial rabbit pyrogen test. This concentration of 0.5 Endotoxin units/ml, which was retrospectively derived from rabbit data, was defined as the threshold level novel pyrogen test would have to meet. Making use of this threshold a very challenging study was designed to evaluate the performance of the novel test for low, but crucial contamination levels. In the validation phase four tests performed reliably with predictive capacity outperforming the rabbit test, for which corresponding results were modelled for the chosen study design.

The evaluation of the rabbit pyrogen test initiated by the validation study triggered an in-depth analysis. Based on a probabilistic model of the rabbit fever reaction, this analysis focused on international harmonization of pharmacopoeial approaches and on modelling of new experimental designs of the rabbit test. Comparing three pharmacopoeial tests strongly demonstrated need for harmonization. Probability curves for pyrogenic classification differed substantially between Pharmacopoeias. Modelling the corresponding animal consumption revealed substantial differences between the pharmacopoeial tests. Using the rabbit model, two new test designs were developed. While maintaining safety levels of current pharmacopoeial tests, animal consumption could be reduced by 30% taking prevalence information on pyrogenicity into account.

In summary, with several studies implementing different principles of evidence-based medicine the usefulness of these principles for in vitro toxicology was demonstrated. Prevalence is a most important information for a comprehensive and complete test assessment. Similar, detailed evaluation of reference tests in validation studies is mandatory to allow an optimal relevance assessment for both reference and in vitro test. Introducing and employing these approaches systematically into the field of in vitro toxicology would constitute a first step towards an evidence-based toxicology.

Obwohl die grundlegenden Prinzipien des Tierschutzes in der Wissenschaft bereits vor fast 50 Jahren definiert wurden, erlauben erst das heutige Verständnis toxikologischer Mechanismen und moderne Bio-Technologien die effiziente Implementierung dieser Prinzipien in die Toxikologie.
In-vitro-Testmethoden wurden und werden immer noch für fast alle wichtigen toxikologischen Endpunkte entwickelt. Dabei steht am Ende der Entwicklung eines vielversprechenden in-vitro-Tests in der Regel eine multi-zentrische Validierungsstudie, um die Verlässlichkeit und Relevanz des Tests beurteilen zu können. Da sich diese Vorgehensweise bewährt hat, ist es nun an der Zeit, diesen Prozess zu optimisieren und weiterzuentwickeln.
Im ersten Abschnitt dieser Arbeit wurde die evidenz-basierte Medizin in der klinischen Diagnose als ein zur Validierung in der in vitro Toxikologie eng verwandtes Gebiet identifiziert. Grundprinzipien der Methodik wurden in die Toxikologie übertragen, wobei der Aspekt der Prävalenz und der Einfluss der Fehlerhaftigkeit des Referenzstandards im Vordergrund standen. Anhand typischer toxikologischer Situationen wurden mehrere Optionen untersucht, wie diese Konzepte in die Toxikologie und besonders deren Testbeurteilung eingeführt werden könnten. Beispielsweise wurde der Begriff der Prävalenz, ein Schlüsselparameter für den praktischen Nutzen eines diagnostischen Tests, auf die Häufigkeit des Auftretens eines toxikologische Endpunkts übertragen oder der Einfluss der Fehlerhaftigkeit des Referenzstandards, in der Regel ein in-vivo-Test, auf die Prävalenz eines toxikologischen Endpunkts modelliert.

Die Prävalenz von hautreizenden Eigenschaften chemischer Substanzen, beurteilt nach dem in-vivo-Referenzstandard, wurde untersucht. Zwei Datenbanken, die Daten des von Regulatoren geforderten Kaninchenexperiments enthalten, wurden in Hinsicht auf verschiedene Prävalenzaspekte analysiert. Die Prävalenz in Bezug auf regulatorische Klassifizierungssysteme wurde im Detail beschrieben, wobei weniger als 10% von 3000 Substanzen ein zu kennzeichnendes Irritationspotential zeigten. Die Analyse der Reproduzierbarkeit innerhalb eines Tierexperiments zeigte, dass diese nur ein geringe Variabilität mit sich bringt. Zuletzt wurde die Prävalenz zusammen mit den Resultaten der experimentellen Variabilität kombiniert, um den generellen Nutzen dieser Vorgehensweise zu verdeutlichen und um schließlich zwei Klassifizierungssysteme zu vergleichen.

Eine große, internationale Validierungsstudie von neuartigen Pyrogenitätstests, die stark auf den gewählten Referenzstandard fokusiert war, wurde biometrisch betreut und detailliert analysiert. In dieser Studie wurden sechs in-vitro-Tests, die auf der menschlichen Fieberreaktion basieren, mit dem regulatorisch vorgeschriebenen Kaninchenpyrogentest verglichen. Um den aus dem Kaninchentest hergeleiteten Wert von 0.5 Endotoxin Einheiten/ml wurde ein anspruchsvolles Studiendesign konstruiert, um die Eigenschaften der neuen Tests für diese niedrigen, aber kritischen pyrogenen Konzentrationen beurteilen zu können. In der Validierungsphase zeigten vier Tests verlässliche Ergebnisse, die besser als die entsprechenden, modellierten Kaninchentestergebnisse waren.

Die Evaluierung des Kaninchenpyrogentest, die durch die Validierungsstudie initiiert wurde, zog eine ausführliche Analyse nach sich. Auf dem entwickelten Kaninchenfiebermodell basierend, konzentrierte sich diese Untersuchung auf die internationale Harmonisierung von regulatorischen Pyrogentests und auf die Modellierung von neuen Versuchdesigns für diesen Kaninchentests. Der Vergleich von drei regulatorischen Tests zeigte dringenden Harmonisierungsbedarf auf. Unterschiede in Wahrscheinlichkeitskurven pyrogener Klassifizierung wurden dargestellt. Auch die Modellierung der entsprechenden, zu verwendenden Tierzahlen machte Unterschiede zwischen den regulatorischen Tests deutlich. Mit Hilfe des Kaninchenfiebermodels wurden schliesslich zwei neue Versuchsdesigns entwickelt. Bei gleichzeitiger Beibehaltung des momentanen Sicherheitsniveaus, reduzierten diese die benötigten Tierzahlen um 30%.

Anhand meherer Studien, die stark auf verschiedenen Prinzipien der evidenz-basierten Medizin fokusiert waren, konnte der Nutzen dieser Prinzipien für die in- vitro-Toxikologie gezeigt werden. Prävalenz ist eine notwendige und wichtige Information, die erst ein umfassende Beurteilung eines Tests ermöglicht. In ähnlicher Weise erlaubt erst eine detaillierte Evaluierung des Referenztests in Validierungsstudien eine optimierte Beurteilung der Relevanz des Referenztests als auch des in-vitro-Tests. Die systematische Einführung und Verwendung dieser Betrachtungsweisen würde ein erster Schritt in Richtung einer evidenz-basierten in-vitro-Toxikologie darstellen, aus der sich für die Toxikologie allgemeingültige evidenz-basierte Prinzipien entwickeln könnten.