The present thesis deals with investigations on an hitherto unknown pathway of resorcinol (1,3-dihydroxybenzene) degradation by the nitrate-reducing bacterium Azoarcus anaerobius.
Resorcinol is oxidized by membrane-bound enzymes via hydroxyhydroquinone (1,2,4-trihydroxybenzene, HHQ) to 2-hydroxy-1, 4-benzoquinone (hydroxybenzoquinone, HBQ). In the focus of this thesis is the further degradation of HBQ and the identification of genes involved in resorcinol degradation.
Degradation of HBQ was investigated in cell-free extracts of A. anaerobius. Resorcinol was converted into stoichiometric amounts of acetate, malate, and succinate in the presence of nitrate and NADH. During resorcinol degradation, unstable aldehydes and ketones were trapped as intermediates by derivatization with 2,4-dinitrophenylhydrazine. The conversion of HBQ to acetate, malate, and succinate was catalyzed only by cell-free extracts of resorcinol-grown cells.
By heterologous expression of a gene library containing fragments of the A. anaerobius genome, a genome fragment R+ was obtained which enabled two Thauera aromatica strains, AR-1 and K 172, to grow with resorcinol as sole carbon and energy source plus nitrate as electron acceptor. The genome fragment R+ was 29.88 kb in size. Physiological and biochemical experiments showed that R+ must harbour genes for resorcinol hydroxylase and HHQ dehydrogenase, and genes for the conversion of HBQ to acetate, malate, and succinate. Genes involved in resorcinol metabolism including the specific regulatory units were assigned to four adjacent gene clusters.
Growth experiments and enzyme activity tests with inhibitors for molybdenum-containing enzymes (arsenite, tungstate, selenite) suggested that a molybdenum-containing enzyme catalysed the hydroxylation of resorcinol to HHQ. Specific motifs of molybdenum-containing enzymes (molybdenum and iron-sulfur binding sites) were found in the genome fragment R+. The respective ORFs, assigned as putative resorcinol hydroxylase, showed identities of ~50% to the a- and b-subunits of the pyrogallol-phloroglucinol transhydroxylase of Pelobacter acidigallici.
Sequences of oligopeptides of a 50 kDa protein from membrane fractions of A. anaerobius grown with resorcinol aligned to the predicted HHQ dehydrogenase in the genome fragment R+. The 50 kDa protein was present in membrane fractions of A. anaerobius, wild-type T. aromatica AR-1 (wt), and the two transconjugantes T. aromatica AR-1 R+ and K 172 R+, independent of the used growth substrate. The intensity of this protein band correlated with the specific activity of HHQ dehydrogenase in the respective cell-free extracts. The observation that the intensity of the 50 kDa protein band and the specific activity of HHQ dehydrogenase both were substantially higher in trans-conjugate T. aromatica AR-1 R+ than in wild-type T. aromatica AR-1 during growth on resorcinol or a-resorcylate suggested that trans-conjugate T. aromatica AR-1 R+ possesses two gene copies for the HHQ dehydrogenase.
The genes for HBQ ring cleavage were assigned to the ORFs that resembled the multi-enzyme complex of pyruvate dehydrogenase on the genome fragment R+. Typical binding-motifs for the co-enzymes and -substrates of pyruvate dehydrogenase (CoA, FAD, NAD+, TPP) were localized. However, addition of these co-enzymes and/or -substrates in cell-free extract experiments did not support resorcinol degradation. HBQ was cleaved most likely in a non-oxidative hydrolytic reaction to a b-ketoacid, which was subsequently cleaved to a C2 and a C4 moiety.
The genes for the subsequent reactions to form acetate, malate, and finally succinate were assigned to putative NADH-dependent, soluble dehydrogenases. These enzymes transformed the C2 moiety to acetate and the C4 moiety via malate to succinate.

Diese Arbeit beschäftigt sich mit der Untersuchung eines bislang unbekannten Weges des Resorcin (1,3-Dihydroxybenzol) Abbaus durch das Nitrat-reduzierende Bakterium Azoarcus anaerobius.
Resorcin wird durch membrangebundene Enzyme über Hydroxyhydrochinon (HHQ, 1,2,4-Trihydroxybenzol) zu Hydroxybenzochinon (HBQ, 2-Hydroxy-1,4-Benzochinon) oxidiert. Der Schwerpunkt der Dissertation liegt auf der Aufklärung des weiteren Abbaus von HBQ und in der Identifizierung der am Resorcinabbau beteiligten Gene.
Der Abbau von HBQ wurde, ausgehend von Resorcin, im zellfreien Extrakt von A. anaerobius untersucht. Resorcin wurde mit Nitrat und NADH stöchiometrisch zu Acetat, Malat und Succinat abgebaut. Während des Resorcinabbaus konnten instabile Aldehyde und Ketone nach Derivatisierung mit 2,4-Dinitrophenylhydrazin als Zwischenprodukte detektiert werden. Der weitere Abbau von HBQ zu Acetat, Malat und Succinat wurde nur in zellfreiem Extrakt von Resorcin-gewachsenen Zellen katalysiert.
Durch heterologe Expression einer Genbibliothek, die Fragmente vom A. anaerobius-Genom enthielt, wurde ein Fragment R+ identifiziert, welches zwei Thauera aromatica Stämme, AR-1 and K 172, befähigte, mit Resorcin als einziger Kohlenstoff- und Energiequelle plus Nitrat als Elektronenakzeptor zu wachsen. Das Genomfragment R+ hatte eine Größe von 29.88 Kilobasen (kb). Durch physiologische und biochemische Experimente konnte gezeigt werden, dass R+ die Gene für die Resorcinhydroxylase, die HHQ-Dehydrogenase und die Gene für die Umwandlung von HBQ zu Acetat, Malat und Succinat enthalten muss. Die am Resorcinstoffwechsel beteiligten Gene sowie die dazugehörigen regulatorischen Einheiten wurden in vier benachbarte Gengruppen zusammengefasst.
Physiologische Experimente und Enzymaktivitätsmessungen in Gegenwart von Hemmstoffen (Arsenit, Selenit, Wolframat) für molybdänhaltige Enzyme legten nahe, daß ein molybdänabhängiges Enzym für die Hydroxylierung von Resorcin zu HHQ verantwortlich war. Typische Motive für molybdänhaltige Enzyme (Molybdän- und Eisen-Schwefel-Bindestelle) wurden auf dem Genomfragment R+ gefunden. Die entsprechenden offenen Leseraster (ORFs) zeigten eine Identität von ca. 50% zu den a- und b- Untereinheiten der Pyrogallol-Phloroglucin-Transhydroxylase von Pelobacter acidigallici und wurden den Untereinheiten der potentielle Resorcinhydroxylase zugewiesen.
Die Oligopeptidsequenzen von einem membrangebundenen Protein mit einer Größe von 50 kDa von A. anaerobius waren identisch mit Sequenzen der potentiellen HHQ-Dehydrogenase auf dem Genomfragment R+. Das 50 kDa große Protein war unabhängig vom verwendeten Wachstumssubstrat in der Membranfraktion von A. anaerobius, Wildtyp T. aromatica AR-1 (wt), und in den Membranfraktionen der beiden Transkonjuganten T. aromatica AR-1 R+ and K 172 R+ vorhanden. Die Dicke dieser Proteinbande korrelierte mit den spezifischen Aktivitäten der HHQ-Dehydrogenase in den entsprechenden Extrakten. Die Tatsache, dass der Gehalt des Proteins mit der Größe von 50 kDa quantitativ größer und die spezifische Aktivität der HHQ-Dehydrogenase um einen Faktor 2 höher war in der Transkonjuganten T. aromatica AR-1 R+ als in T. aromatica AR-1 wt während des Wachstums auf Resorcin oder a-Resorcylat (3,5-Dihydroxybenzoat) legt nahe, dass die Transkonjugante T. aromatica AR-1 R+ über zwei Genkopien für die HHQ-Dehydrogenase verfügt.
Die Gene für die HBQ-Ringspaltung wurden den ORFs des Multienzymkomplexes einer Pyruvat-Dehydrogenase auf dem Genomfragment R+ zugeordnet. Typische Bindemotive für Coenzyme und -substrate der Pyruvat-Dehydrogenase (CoA, FAD, NAD+, TPP) wurden lokalisiert. Jedoch unterstützten die zugegebenen Coenzyme und/ oder -substrate in Experimenten mit zellfreiem Extrakt nicht den Abbau von Resorcin. HBQ wird wahrscheinlich in einer nicht-oxidativen hydrolytischen Reaktion zu einer b-Ketosäure gespalten, die durch eine weitere Spaltung in eine C2 und eine C4 Einheit zerlegt wird.
Die Gene für die den weiteren Abbau zu Acetat, Malat and schließlich zu Succinat wurden potentiellen NADH-abhängigen, löslichen Dehydrogenasen zugeordnet. Diese Enzyme können die C2-Einheit zu Acetat und die C4-Einheit über Malat zu Succinat umwandeln.