Retinoic acid (RA) is a key signal involved in the posteriorization of vertebrate neural ectoderm. The major enzyme involved in biosynthesis of RA during embryonic development is retinaldehyde dehydrogenase 2 (Raldh2). A zebrafish mutant in raldh2 (neckless; nls), which is devoid of RA signalling during embryonic development, exhibits anterior-posterior (AP) patterning defects in the neural ectoderm. Using the nls mutant I found that loss of RA also affects AP patterning of the cranial mesoderm. I depleted RA signalling in embryos and found that markers of the posterior cranial mesoderm are shortened along the AP axis, correlating with the severity of RA depletion. I determined the timing for requirement of RA to establish the AP-level of the posterior border of head mesoderm. Together with the pattern of raldh2 expression, I conclude that during gastrulation, RA biosynthesis in prospective mesoderm is a key signal for the specification of the AP extent of the posterior cranial mesoderm. RA-antagonist experiments further reveal that AP-patterning processes are coordinated between the neural tube and the paraxial mesoderm, aligning the hindbrain-spinal cord and head-trunk mesoderm boundaries.
Vertebrate forelimbs arise as bilateral appendages from the lateral plate mesoderm (LPM). nls mutants have been used to show that initiation of limb development and patterning of the limb bud are crucially dependent on RA signaling. However, the timing and cellular origin of RA signaling in these processes have remained poorly resolved. We have used genetics and chemical modulators of RA signaling to solve these issues in the zebrafish. By rescuing pectoral fin induction in the aldh1a2/neckless mutant with exogenous RA and by blocking RA signaling in wild type embryos, we find that RA acts as a permissive signal that is required during the 6-8 somite stages for pectoral fin induction. Cell-transplantation experiments show that RA production is not only critically required from flanking somites, but is sufficient for fin bud initiation when the trunk mesoderm is genetically ablated. Under the latter condition, intermediate mesoderm alone cannot induce the pectoral fin field in the LPM. We further show that induction of the fin field is directly followed by a continued requirement for somite-derived RA signaling to establish a prepattern of antero-posterior fates in the condensing fin mesenchyme. This process is mediated by the maintained expression of the transcription factor hand2, through which the fin field is continuously posteriorized. Thus RA signaling from flanking somites plays a dual early role in the condensing limb bud mesenchyme.
Mutations in leucine-rich glioma-inactivated 1 (LGI1) have been shown to cause an idiopathic epilepsy syndrome, ADLTE. Using expression data of lgi genes in zebrafish and molecular evolutionary analysis among a complete set of nucleotide sequences of the vertebrate LGI sub-groups, I showed that all vertebrate LGI1 and LGI4 genes appear to be under strong purifying selection, the other groups show a pattern of more relaxed selection. Thus, statistical evolutionary tests using the PAML software, in conjunction with expression analyses, can be utilized to determine evolutionary constraints within gene families and help to explain the etiology of ADLTE.
LGI genes share a conserved domain with the Very Large G-protein coupled Receptor-1 (VLGR1/Mass1/USH2C) gene, which is mutated in a murine model of epilepsy. Mutations in VLGR1 are associated with audiogenic epilepsy in mice and Usher syndrome (sensorineural deafness and retinitis pigmentosa) in humans. I characterized the zebrafish VLGR1 gene (vlgr1). It is 51% identical to human VLGR1 in amino acid sequence, but is 64% identical in the 7-transmembrane and cytoplasmic domains. It is 6199 amino acids in size and is encoded by a 19.2 kb mRNA. All introns correspond in location and phase to those of the human and mouse genes. In situ hybridization studies of zebrafish embryos demonstrate high level vlgr1 expression in the developing CNS, particularly in the diencephalon, surrounding the third, tectal and fourth ventricles, and associated with the optic nerve. Further studies using zebrafish may help ascertain the role of Vlgr1 in neural development.

Retinaldehyd-Dehydrogenase 2 (Raldh2) steuert die Retinsäurebiosynthese während der Embryonalentwicklung. Mithilfe einer Zebrafisch-Mutante in raldh2 (nls) und durch die Blockierung des RA-Signalwegs konnte ich zeigen, dass RA in der Embryogenese zur Bildung der antero-posteriorem (AP) Achse des cranialen Mesoderms benötigt wird, welches in Abhängigkeit von der RA Konzentration entlang der AP-Achse verkürzt wird. Ich konnte ferner zeigen, dass die RA-Biosynthese während der Gastrulation im Mesoderm als Schlüsselsignal fungiert und dass die Musterbildung entlang der AP-Achse zwischen Neuralrohr und paraxialem Mesoderm koordiniert wird.
Ich beschäftigte mich ausserdem mit den Fragen nach Ursprung, Zeitpunkt und Funktion des RA-Signals während der Entwicklung der Pektoralflosse. nls-Mutanten exprimieren nicht tbx5, einen der ersten Marker der Brustflossenentwicklung. Raldh2 wird während Gastrulation und Somitogenese besonders stark im somitischen und pronephrischen Mesoderm exprimiert. raldh2-Expression im posterioren Flossenmesenchym während des Wachstums der Pektoralflosse deutet darauf hin, dass eine zweite Phase der RA Signalkaskade existiert. Um den Zeitpunkt des RA-Signals für die Entwicklung des Flossenmesenchyms zu bestimmen, behandelte ich nls- Embryonen mit RA. Eine Behandlung bis 12-13 hpf (Stunden nach der Befruchtung; hours post fertilization) und früher gewährleistet die tbx5 Expression, während Inhibition der RA-Signalkaskade nach 14 hpf zu keinem Effekt führt. Das RA-Signal wird folglich während eines kurzen Zeitfensters in der Somitogenese benötigt. Ich untersuchte anschließend, ob die Quelle von RA, die zur Entwicklung der Brustflossen führt, mit der Expression von raldh2 im somitischen Mesoderm oder im intermediären Mesoderm korrelliert. Das Fehlen von Pektoralflossen in no tail/spadetail (ntl/spt) Doppelmutanten, denen das somitische Mesoderm fehlt, unterstützt die These, dass ein somitisches RA-Signal das Flossenfeld induziert. Behandlung von ntl/spt Embryonen mit RA nach der Gastrulation stellt die tbx5-Expression im pektoralen Flossenfeld wieder her. Um den Ursprung von RA während der Entwicklung der Pektoralflosse zu bestimmen, transplantierte ich Wildtypzellen in nls-mutante Embryonen. Transplantate in die ersten sieben Somiten einer nls-Mutante stellten die tbx5 Expression in der Pektoralflosse wieder her, während Zellen posterior zum siebten Somiten keinen Effekt hervor riefen.
Mutationen im leucine-rich glioma-inactivated 1 Gen (LGI1) verursachen das idiopathische Epilepsie-Syndrom ADLTE (Autosomal Dominant Lateral Temporal Lobe Epilepsy). Idiopathische Epilepsien wurden als Channelopathien angesehen, da alle bisher identifizierten Mutationen, die solche Epilepsien verursachen, in Kanalprotein-kodierenden Genen gefunden wurden. LGI1 ist die erste Ausnahme und gehört einer Genfamilie mit vier Mitgliedern an (LGI1-4). Ich habe fünf Zebrafisch-lgi-Gene kloniert. Der Zebrafisch besitzt zwei lgi1 (lgi1a und lgi1b), zwei lgi2 (lgi2a und lgi2b) und ein lgi3 Gen. lgi1a und lgi1b werden im zentralen Nervensystem (ZNS) exprimiert, während lgi2a, lgi2b und lgi3 nur in wenigen neuronalen Zellen exprimiert werden. Darüber hinaus wird lgi3 in der Embryonalanlage des Herzens exprimiert. Die Rolle von LGI1 in ADLTE korreliert daher mit der ZNS-weiten Expression der beiden semi-Orthologe im Zebrafisch. Eine molekulare phylogenetische Analyse innerhalb der Nukleotidsequenzen der LGI-Unterfamilien von Mensch, Maus, Pufferfisch und Zebrafisch zeigten unterschiedliche Selektionsmuster. Während alle LGI1- und LGI4- Gene starke reinigende (purifying) Selektion erfahren, zeigen die anderen Gruppen ein Muster von entspannter (relaxed) Selektion. Statistische evolutionäre Tests, die sich der PAML-Software bedienen, können demnach zusammen mit Expressionsanalysen dazu benutzt werden, um evolutive Zwänge innerhalb von Genfamilien zu bestimmen und in diesem Fall der Aufklärung der Etiologie von ADTLE dienen.
LGI Proteine besitzen eine konservierte Proteindomäne mit dem Very Large G-Protein coupled Receptor-1 (VLGR1), dessen Gen in einem Epilepsie-Maus-Modell mutiert ist. Mutationen in VLGR1 sind assoziiert mit audiogener Epilepsie in Mäusen und mit Usher Syndrom (sensorische Taubheit und retinitis pigmentosa) im Menschen. Ich habe das Zebrafisch VLGR1 Gen (vlgr1) im Zebrafisch charakterisiert. Es ist zu 51% mit der humanen Aminosäuresequenz identisch, und zu 64% identisch in der Transmembran- und der cytoplasmatischen Domäne. Die 19,2 kb große mRNA kodiert für 6199 Aminosäuren. Alle Introns entsprechen in ihrer Anordnung und Reihenfolge den Genen von Mensch und Maus. Genexpressionsanalysen im Zebrafisch deuten auf starke Expression im sich entwickelnden ZNS hin, insbesondere im Diencephalon, um den dritten, tectalen und vierten Ventrikel herum sowie entlang dem optischen Nerv. Weitere Studien im Zebrafisch könnten helfen, die Rolle von Vlgr1 in der neuronalen Entwicklung genauer zu erforschen.