Manipulation der Selektivität von DNA-Polymerasen : chemisch modifizierte Substrate und optimierte Enzyme zur Analyse und Anwendung
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Es werden verschiedene Methoden vorgestellt um Einfluss auf die Selektivität von DNA-Polymerasen zu nehmen. In einem ersten Teil werden chemisch modifizierte Substrate präsentiert, die zum Einen als sterische Sonden eingesetzt werden. Dadurch wird eine dynamische Abschätzung der Rigidität des aktiven Zentrums von DNA-Polymerasen ermöglicht. Außerdem werden chemisch modifizierte DNA-Primer verwendet, durch die die Genauigkeit von DNA-Polymerasen in der Art erhöht wird, dass eine robuste Einzelnukleotidanalyse durch allelspezifische Amplifikation (ASA) möglich wird.
Im zweiten Teil der Arbeit werden erfolgreiche Ansätze zur genetischen Optimierung einer Taq-DNA-Polymerase beschrieben, in denen, durch zufällige Variation von drei Aminosäuren im sogenannten Motiv C, eine Erhöhung der Genauigkeit der Primerverlängerungsreaktion erreicht wird. Auch diese so identifizierten Enzymvarianten haben eine erhöhte Genauigkeit in der ASA und können somit die Diagnose von Einzelnukleotidvariationen im Genom erheblich vereinfachen.
Zusammenfassung in einer weiteren Sprache
Different methods to affect the selectivity of DNA Polymerases are presented. First chemically modified substrates are introduced as steric probes to allow to evaluate the rigidity of the active site of DNA Polymerases dynamically. Furthermore chemically modified DNA Primerstrands are used to increase the fidelity of DNA Polymerases in a way that a robust singlenucleotide analysis using allelespecific amplification (ASA) becomes possible. In a second part of this thesis successful approaches to genetically optimize a Taq DNA Polymerase are described which use random mutagenesis of three amino acids in the so called Motive C. A significant increase of the fidelity of the primer extension reaction could be reached. The identified enzyme variants also have a positive impact on the fidelity of the ASA and could therefore simplify the diagnosis of genomic singlenucleotide variations.
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ISO 690
STRERATH, Michael, 2006. Manipulation der Selektivität von DNA-Polymerasen : chemisch modifizierte Substrate und optimierte Enzyme zur Analyse und Anwendung [Dissertation]. Konstanz: University of KonstanzBibTex
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