Transhydroxylase aus Pelobacter acidigallici-Das strikt anaerobe Bakterium Pelobacter acidigallici vergärt Gallussäure (3,4,5-Trihydroxybenzoesäure), Pyrogallol (1,2,3-Trihydroxybenzol), Phloroglucin (1,3,5-Tri-hydroxybenzol) oder 2,4,6-Trihydroxybenzoesäure zu drei Molekülen Acetat (plus CO2) [Brune et al., 1990; Schink et al., 1982]. Ein Schlüsselenzym dieses Abbauweges ist die Pyrogallol-Phloroglucinol Transhydroxylase (TH), welche in Abwesenheit von O2 Pyrogallol zu Phloroglucinol umsetzt in Anwesenheit von 1,2,3,5-tetrahydroxybenzene als Cosubstrat. Ein möglicher Reaktionsmechanismus wurde von Messerschmidt et al., (2004) auf der Grundlage einer hochaufgelösten Röntgenstruktur vorgeschlagen.
Die funktionelle Einheit der Transhydroxylase von P. acidigallici ist ein Heterodimer bestehend aus einer großen (100.4 kDa) und einer kleinen Untereinheit (31.3 kDa). Dieses Enzym ist nahe verwandt mit Enzymen aus der Familie der DMSO-Reduktasen. Obwohl die von der TH katalysierte Reaktion formal keine echte Redox-Reaktion ist, enthält das Enzym drei [4Fe-4S] -Zentren und ein Mo(MGD)2 als Redox-Kofaktoren. Die EPR Spektren (Proben eingefroren bei verschiedenen Redoxpotentialen) zeigten einen Satz komplizierter Resonanzen in Abhängigkeit vom eingebauten Molybdän-Isotop, vom pH der Lösung, und von der Anwesenheit von Anionen wie zB. Chlorid. Die EPR Daten der Mo-TH deuteten auf ein Gleichgewicht hin zwischen zwei Mo(V)-Spezies: Mo(V)-OH2 und Mo(V)-OH. Die Aminosäuren Aspartat und Histidin am aktiven Zentrum scheinen essentiell zu sein für die Katalyse. Inkubationsexperimente mit dem Substrat Pyrogallol und dem möglicher Intermediat 2,4,6,3 ,4 ,5 -hexahydroxydiphenylether ergaben eine geringe Abnahme des Mo(V) EPR-Signals. Im Falle reduzierter Mo-TH führen diese beiden Verbindungen zu einer partiellen Oxidation der Metallzentren, was durch EPR Spektroskopie gezeigt wurde. Dagegen wurde unter gleichen Bedingungen mit dem Kosubstrat 1,2,3,5-tetrahydroxybenzol eine Abnahme des Mo(V) EPR-Signals und die Reduktion der [4Fe-4S]-Zentren erreicht. Ein möglicher Elektronen-Transfer-Weg ausgehend von Mo(MGD)2 in der α-Untereinheit via eines Arginin-Restes zum benachbarten [4Fe-4S]-Cluster in der β-Untereinheit wurde vorgeschlagen.

Acetylen Hydratase aus Pelobacter acetylenicus-Das strikt anaerobe, mesophile δ-Bakterium Pelobacter acetylenicus wandelt den ungesättigten Kohlenwasserstoff Ethin (Trivialname: Acetylen) zu Acetat und Ethanol um, mit Acetaldehyd als Zwischenprodukt [Abt, 2001; Kisker et al., 1998; Schink, 1985]. Der erste Schritt dieses Gärungsweges ist die Anlagerung von Wasser an die Dreifachbindung von Acetylen, die von der Acetylen Hydratase (AH) katalysiert wird [Rosner et al., 1995].
AH aus P. acetylenicus wurde bis zur Homogenität gereinigt. Die funktionelle Einheit ist das Monomer mit einer molekularen Masse der Aminosäurenkette von 81.9 kDa. Sequenz- und Strukturvergleiche ordnen das Enzym der Familie der DMSO-Reduktasen zu. Es enthält ein W(MGD)2-Zentrum und ein [4Fe-4S]-Cluster vom Cubane-Typ. Wolfram kann durch Molybdän ersetzt werden, die entsprechende Mo-AH zeigt eine signifikant geringere Aktivität. ICP/MS, EPR und UV/VIS-Spektroskopie zeigen, dass P. acetylenicus sowohl Wolfram als auch Molybdän in das Aktivzentrum der AH einbauen kann. Die W-AH sticht unter den andere Mitgliedern der DMSO Familie hervor, da sie mit der Hydratisierung von Acetylen zu Acetaldehyd keine Redox-Reaktion katalysiert. Dabei ist zu beachten, dass das Enzym für die Katalyse durch Natriumdithionit oder Ti(III)-Zitrat reduktiv aktiviert werden muss.
EPR-spektroskopische Untersuchungen Dithionit-reduzierter W-AH und Mo-AH zeigen die charakteristischen Resonanzen eines [4Fe-4S]-Zentrums, mit gav = 1.966  0.001. Die mit K3[Fe(CN)6] oxidierte W-AH zeigt das EPR Signal eines W(V)-Zentrums, mit gav = 2.02. Im gegensatz dazu zeigt die Mo-AH ( wie isoliert ) Resonanzen eines Mo(V)-Zentrums, mit gav = 1.99.
W-AH wurde unter striktem Ausschluß von Luftsauerstoff in seiner aktiven, reduzierten Form kristallisiert. Die Kristallstruktur wurde mit einer Auflösung von 1.26 Å erarbeitet. Das W(MGD)2-Zentrum bindet neben einem Cystein-Schwefel einen Sauerstoff-Liganden Wasser oder eine Hydroxygruppe der mit dem benachbarten Aspartat 13 wechselwirkt. Aufbauend auf diesen strukturellen und spektroskopischen Ergebnissen wurde ein erster möglicher Reaktionsmechanismus für die Anlagerung von Wasser an die Acetylen-Dreifachbindung unter Ausschluß von Luftsauerstoff formuliert. Acetylen wird in eine hydrophobe Tasche des Enzyms modelliert, direkt über einem Wasssermolekül, welches an das W(MGD)2-Zentrum gebunden ist. Damit das Substrat Zugang zu diesem neuartigen Aktivzentrum erhalten kann, entwickelt das Protein einen speziellen Substratkanal, weit entfernt von der Stelle, an der dieser normalerweise in anderen Molybdän- und Wolfram-haltigen Enzymen der DMSO Reduktase Familie gefunden wird.

Transhydroxylase from Pelobacter acidigallici-The strictly anaerobic bacterium Pelobacter acidigallici ferments gallic acid (3,4,5-trihydroxybenzoic acid), pyrogallol (1,2,3-trihydroxybenzene), phloroglucinol (1,3,5-trihydroxy-benzene), or 2,4,6-trihydroxybenzoic acid to three molecules of acetate (plus CO2) [Brune et al., 1990; Schink et al., 1982]. A key enzyme in the fermentation pathway is pyrogallol phloroglucinol transhydroxylase (TH), which converts pyrogallol to phloroglucinol in the absence of O2, in the presence of 1,2,3,5-tetrahydroxybenzene as a cosubstrate. The proposed reaction scheme was described by Messerschmidt et al., (2004) based on a high resolution structure of TH.
Transhydroxylase from P. acidigallici is a heterodimer consisting of a large subunit (100.4 kDa) and a small subunit (31.3 kDa). This enzyme is closely related to enzymes of the DMSO-reductase family. Although the overall reaction of transhydroxylase is no redox reaction it contains three [4Fe-4S] centers and one Mo(MGD)2 as redox-cofactors. The EPR spectra of the Mo(V) site (samples frozen at different redox potentials) revealed a very complex pattern of resonances dependent on the molybdenum isotope inserted, the pH of the solution, and the presence of anions such as chloride. The EPR study of the Mo(V) center suggested the presence of two Mo(V) species in equilibrium, Mo(V)-OH2 and Mo(V)-OH, with at 1.996, 1.982, 1.963. The amino acids aspartate and histidine near the active site seem to be essentiell for catalysis. Incubation experiments of Mo-TH (as isolated and reduced by dithionite) with pyrogallol, or the putative intermediate 2,4,6,3 ,4 ,5 -hexahydroxydiphenyl ether, showed a rather small decrease in intensity of the Mo(V) EPR signal; in the case of reduced Mo-TH, these compounds caused partial oxidation of the metal sites. Surprisingly, the co-substrate 1,2,3,5-tetrahydroxybenzene led to a decrease of the Mo(V) EPR signal, and to a reduction of the Fe-S centers as shown by EPR spectroscopy. A putative electron transfer pathway from the Mo(MGD)2 unit on the α-subunit of TH via an arginine residue to the close by [4Fe-4S] on the β-subunit has been assigned.

Acetylene hydratase from Pelobacter acetylenicus-The strictly anaerobic, mesophilic, δ-bacterium Pelobacter acetylenicus converts the unsaturated hydrocarbon ethine (trivial name, acetylene) to acetate and ethanol via acetaldehyde as an intermediate [Abt, 2001; Kisker et al., 1998; Schink, 1985]. The first step of the fermentation pathway, the hydration of acetylene to acetaldehyde, is catalyzed by the enzyme acetylene hydratase [Rosner et al., 1995].
Acetylene hydratase (AH) from P. acetylenicus was purified to homogeneity. It is a monomer with a molecular mass of the amino acid chain of 81.9 kDa. Sequence and structure comparisons group the protein into the DMSO-reductase family. It contains a W(MGD)2 center and a cubane-type [4Fe-4S] cluster. Tungsten can be replaced by molybdenum, the corresponding Mo-AH is quite less active. ICP/MS, EPR, and UV/Vis-spectroscopy revealed that P. acetylenicus is able to insert tungsten as well as molybdenum into the bisMGD cofactor of acetylene hydratase. W-AH stands out from its family class because it catalyzes a non-redox reaction, the hydration of acetylene to acetaldehyde. Note that the enzyme requires reduction by either Na-dithionite or Ti(III) citrate.
EPR spectroscopic investigation of dithionite-reduced W-AH and Mo-AH showed signals of a [4Fe-4S] center, with gav = 1.966  0.001. W-AH oxidized by K3[Fe(CN)6] exhibited resonances of a W(V) center, with gav = 2.02. The as isolated Mo-AH showed resonances of a Mo(V) center, with gav = 1.99.
W-AH has been crystallized under the strict exclusion of dioxygen in its active, reduced state. The crystal structure of W-AH was determined at 1.26 Å resolution. The structure showed that the tungsten center binds a water molecule (or OH-group) which can closely interact with a nearby aspartate residue. These structural and spectroscopic results led to the proposal of a reaction mechanism. Hereby, the acetylene molecule is placed into hydrophobic pocket, directly above a water/OH molecule coordinated to tungsten. Two different reactions mmight then take place: electrophilic addition leading to vinyl cation as intermediate or nucleophilic attack yielded vinyl anion with acetylene. Access to this novel W Asp active site has been made possible by a substrate channel at a position distant from those found in other molybdenum and tungsten enzymes.