Poly(ADP-ribosyl)ation is one of the very early cellular responses to genotoxic insults and is catalyzed by the family of poly(ADP-ribose) polymerases (PARPs). Using NAD+ as substrate, PARPs synthesize the biopolymer poly(ADP-ribose) (PAR), comprising up to 200 ADP-ribose units (Burkle 2005). This complex biopolymer interacts with a number of proteins involved in DNA damage checkpoint and repair via a specific consensus motif (Pleschke et al. 2000).
Objective of the thesis was to characterize the noncovalent interaction between sizefractionated PAR and specific binding partners such as p53 in terms of selectivity and affinity. PARP-1, the xeroderma pigmentosum-A [XPA] protein, p53 and WRN were overexpressed in Sf9 insect cells using the baculovirus system and purified to homogeneity. PAR was synthesized in vitro and efficiently biotin-labeled at the terminal ribose using the carbonylreactive compound biocytin hydrazide. Following anion exchange HPLC fractionation, the fractions collected were monitored for chain length on modified sequencing gels by silver staining and revealed isolated PAR chains ranging from 6 up to 70 ADP-ribose units. Interaction of separated PAR chains and recombinant proteins were studied by slot blot analysis and a novel electrophoretic mobility shift assay (EMSA). Moreover, real-time surface plasmon resonance (SPR) was used to assess binding kinetics and stoichiometry.
Slot blot experiments, which monitored the binding of PAR of a defined size class to immobilized proteins, clearly indicated a pivotal role for PAR chain length. EMSA studies were performed to monitor the binding affinities in solution. Long ADP-ribose chains (55-mer) promoted the formation of three specific complexes with p53. Short PAR chains (16mer) were also able to bind p53, yet forming only one defined complex. By contrast, XPA did not interact with short polymer, but did produce a single complex with long PAR chains (55mer). In the present work, the oncoprotein DEK was identified as a novel member of the PARbinding protein family. Like XPA, DEK underwent complex formation with long PAR chains, however with much higher affinity, but did not interact with short PAR. Finally, SPR analysis was carried out with immobilized PAR chains, which allowed establishing binding constants. In line with the EMSA experiments XPA did not bind to short PAR (14mer), but displayed a high affinity for long PAR chains (63mer), whereas p53 interacted strongly with both short and long PAR chains.
In summary, it was demonstrated that the affinity of the noncovalent PAR interaction with specific binding proteins (DEK, XPA, p53) can be very high (low nM range) and is dependent both on the PAR chain length and on the binding protein. These findings provide evidence for the existence of a cellular "PAR code", i.e. the ability of PAR to engage in different cellular signaling pathways as a function of PAR chain length.

Die Poly(ADP-Ribosyl)ierung ist eine der ersten zellulären Antworten auf genotoxischen Stress und wird von der Familie der Poly(ADP-Ribose) Polymerasen (PARPs) katalysiert. PARPs synthetisieren unter Verwendung von NAD+ das Biopolymer Poly(ADP-Ribose) (PAR), welches bis zu 200 ADP-Ribose Einheiten enthalten und mehrere Verzweigungsstellen aufweisen kann (Burkle 2005).
Dieses komplexe Biopolymer interagiert über ein spezifisches Konsensus-Motiv nichtkovalent mit einer Reihe von Proteinen, welche an der DNA-Schadenserkennung und DNAReparatur beteiligt sind (Pleschke et al. 2000). Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die nichtkovalente Interaktion zwischen fraktionierter PAR und spezifischen Bindeproteinen wie beispielsweise p53 im Hinblick auf Selektivität und Affinität zu charakterisieren.
Hierzu wurden die Proteine PARP-1, das Xeroderma pigmentosum-A (XPA) protein, p53 sowie WRN in Insektenzellen mit Hilfe des Baculovirus-Systems überexprimiert und durch chromatographische Verfahren bis zur Homogenität aufgereinigt. PAR wurde dann in vitro synthetisiert und unter Verwendung der Carbonyl-reaktiven Substanz Biocytin Hydrazid an der terminalen Ribose effizient mit Biotin markiert. Nach Fraktionierung des biotinylierten Polymers mittels Anionenaustauscher-HPLC wurden die gesammelten Fraktionen auf einem modifizierten DNA Sequenzierungsgel untersucht, um die Kettenlänge zu ermitteln. Mittels Silberfärbung des Gels konnten Polymere detektiert werden, welche eine Kettenlänge von 6 bis zu 70 ADP-Ribose Einheiten aufwiesen. Die Interaktion von fraktionierter PAR und rekombinanten Proteinen wurde im Folgenden durch Slot Blot Analyse und durch einen neuartigen PAR Gelshift (EMSA) untersucht. Darüber hinaus wurden Oberfächenplasmonenresonanz (SPR)-Studien in Echtzeit durchgeführt, welche sowohl die Bestimmung der Bindungskinetiken als auch der jeweiligen Stöchiometrie erlaubten.
Slot Blot Experimente, bei welchen die Bindung von PAR einer definierten Größenklasse an immobilisierte Proteine erfasst wird, zeigten eine zentrale Rolle der PAR Kettenlänge. Um die Bindungsvorgänge in Lösung zu charakterisieren, wurde eine EMSA Versuchsreihe angesetzt. Lange PAR-Ketten (55mer) induzierten die Bildung von drei verschiedenen Komplexen mit p53. Kurze PAR-Ketten (16mer) interagierten ebenfalls mit p53, produzierten jedoch nur einen spezifischen Komplex. Im Gegensatz dazu wies XPA keine spezifische Bindung an kurzes Polymer auf, erzeugte aber einen einzelnen Komplex mit langem Polymer. Dieses Verhalten wurde auch bei DEK beobachtet, welches als neues Mitglied der PAR-Bindeprotein-Familie identifiziert wurde. DEK bildete ähnlich wie XPA mit langen PARKetten einen spezifischen Komplex, jedoch mit deutlich höherer Affinität. Mit kurzen PARKetten konnte keine Interaktion detektiert werden. Zuletzt wurden SPR-Studien durchgeführt, wozu biotinylierte, fraktionierte PAR gezielt immobilisiert wurde und eine Bestimmung der Bindungskinetiken ermöglichte. In Übereinstimmung mit den erhaltenen EMSA Resultaten konnte gezeigt werden, dass XPA nicht an kurze Ketten (14mer) bindet, wohingegen mit langen PAR-Ketten (63mer) eine spezifische, hochaffine Interaktion detektiert wurde. Wie auch im EMSA beobachtet, interagierte p53 stark sowohl mit kurzen als auch langen PARKetten.
Zusammenfassend konnte demonstriert werden, dass die Bindungsaffinität der nichtkovalenten PAR-Protein Interaktion bei allen untersuchten Proteinen (DEK, p53, XPA) außerordentlich hoch war, was durch KD -Werte im unteren nM Bereich verdeutlicht wird. Weiterhin konnte klar herausgearbeitet werden, dass die spezifische Bindung sowohl von der PAR-Kettenlänge als auch dem jeweiligen Protein abhängt. Diese Resultate sprechen deutlich für die Existenz eines zellulären "PAR-Codes", d.h. die Fähigkeit von PAR, in Abhängigkeit der Kettenlänge mit verschiedenen Proteinen zu interagieren und darüber zelluläre Signalwege zu modulieren.