The Use of NeoHepatocytes for Assessment of Metabolism-Dependent Human Acute Toxicity
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Zusammenfassung
Deutsche Zusammenfassung:
REACH (Registrierung, Evaluation und Zulassung von Chemikalien) ist eine neuen EU-Verordnung zur Sicherheit chemischer Stoffe (seit 1. Juni 2007 in Kraft). Bis heute wird der Großteil der Chemikalientestung an Tieren durchgeführt oder basiert auf Leberzellen der verschiedensten Spezies. Das Ziel des Europäischen Zentrums zur Validierung von Alternativen Methoden zu Tierversuchen (ECVAM) ist es, neue, möglichst humane in vitro Systeme als Ersatz zum Tierversuch zu validieren.
In dieser Arbeit wurde ein, auf menschlichen NeoHepatozyten basiertes Testsystem entwickelt, das zur Bewertung von Metabolismus abhängiger, Chemikalien induzierter, akuter Toxizität dient. Dieses Testsystem ist preisgünstig und geeignet für High Throughput Screening (HTS). Eine Standardarbeitsanweisung (SOP) wurde ausgearbeitet, angepasst und auf einer automatisierten Plattform getestet.
Im Hinblick auf eine mögliche klinische Nutzung von NeoHepatozyten, wurden erste Vorversuche zur Fragestellung gemacht, ob diese Zellen ihre Sensitivität gegenüber der rezeptorabhängigen Apoptose behalten.
Im Einzelnen wurden folgende Ergebnisse erzielt:
- Ein Zytotoxizitäsassay basierend auf der Freisetzung von Laktatdehydrogenase (LDH) wurde an die speziellen Zellkulturbedienungen der NeoHepatozyten angepasst.
- Durch das indirekte Hepatotoxin Paracetamol konnte eine konzentrationsabhängige Zytotoxizität in primären murinen und humanen Hepatozyten, so wie NeoHepatozyten induziert werden. Obwohl die mit NeoHepatozyten erzielten EC50 variierten (5mM-20mM), zeigen die Daten, dass diese Zellen (mittlere absolute Toxizität bei 30%) im Gegensatz zu HepG2 Zellen (7%) den primären humanen Hepatozyten (37%) gleichkommen.
- Standardarbeitsanweisung (SOP) wurde erstellt, während Intralabor- und Interlaborversuchen anhand von neun verschiedenen Chemikalien (direkte und indirekt toxische Substanzen) präzisiert und führte zu reproduzierbaren Ergebnissen.
- Der Assay wurde auf eine computergesteuerte, automatisierte Plattform am Europäischen Zentrum zur Validierung von Alternativen Methoden zu Tierversuchen (ECVAM), Ispra, Italien übertragen.
- Die FACS-Analyse zeigte das Vorhandensein und die zeitabhängige Zunahme von Todesrezeptoren auf der Zelloberfläche. Allerdings konnten NeoHepatozyten nicht mit ActD oder CHX für den TNFα oder CD95L-induzierten Zelltod sensitiviert werden.
Im Rahmen dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die Weiterentwicklung von NeoHepatozyten für die Risikobewertung direkter und im Besonderen indirekter Hepatotoxine ein großes Potential birgt.
Zusammenfassung in einer weiteren Sprache
Abstract:
REACH (Registration, Evaluation and Authorization of Chemicals) is a regulatory initiative of the EU Commission for the safety of chemicals which came (in force since June, 1st, 2007). At present, a majority of chemical testing is animal-based or on the exposure of hepatocytes from mainly animal species. The European Centre for the Validation of Alternative Methods (ECVAM) validates new, optimally human in vitro systems to replace animal experiments.
Here a test system was established, based on human NeoHepatocytes for the assessment of metabolism-dependent, chemically induced acute toxicity. It is inexpensive and suitable for High Throughput Screening (HTS). A Standard Operating Procedure (SOP) was elaborated, adjusted and tested on a robotic platform. As to potential clinical use of NeoHepatocytes, orientating experiments were performed as to their sensitivity towards receptor-dependent apoptotic cell death.
In detail the following results were obtained:
- A cytotoxicity assay using the release of lactate dehydrogenase (LDH) was adapted for the special culture conditions of NeoHepatocytes.
- Concentration-dependent cytotoxicity was induced by the indirect hepatotoxin Paracetamol in primary murine and primary human hepatocytes as well as in NeoHepatocytes. Even though varying EC50 values (5mM-20mM) were obtained with NeoHepatocytes from different donors, the data indicate that these cells (mean absolute toxicity 30%) gave the best match to primary human hepatocytes (37%) while the human liver cell line HepG2 (7%) failed to do so.
- An SOP was established, refined in intralaboratory and interlaboratory studies with nine chemical compounds (thereof direct and indirect toxic substances) and led to reproducible results.
- The assay was successfully transfered to a computer-controlled robotic platform at the European Centre for the Validation of Alternative Methods (ECVAM), Ispra, Italy.
- Applicability and performance with NeoHepatocytes was tested on the High Throughput System. Controlled quality and standardised testing of compounds were achieved.
- FACS-analysis revealed the presence and time-dependent increase of death receptors on the cell surface. However, NeoHepatocytes were not sensitive to ActD or CHX sensitized cell death induced by TNFα or CD95L
In summary, the results of this thesis encourage the further development of NeoHepatocytes for risk assessment of direct and particularly indirect hepatotoxins.
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ISO 690
POCHIC, Isabelle, 2008. The Use of NeoHepatocytes for Assessment of Metabolism-Dependent Human Acute Toxicity [Dissertation]. Konstanz: University of KonstanzBibTex
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