Die vorliegende Arbeit hatte zum Ziel, die Beteiligung von Caspasen und Serinproteasen an der Apoptose von Leberzellen zu untersuchen, welche zum einen durch Todesrezeptorliganden und zum anderen durch Stimulantien des intrinsischen Weges ausgelöst wurde. Zusätzlich wurden verschiedene pharmakologische Wirkstoffen, welche epigenetische Regulationsmechanismen beeinflussen, auf ihre Fähigkeit hin untersucht, das HepG2-Zellmodell gegenüber Todesrezeptor-stimulierte Apoptose zu sensitiveren.
1. Im Gegensatz zu primären murinen Hepatozyten war die Hemmung von Caspasen in primären humanen Hepatozyten und HepG2-Zellen durch zVAD-fmk nicht ausreichend, um einen Schutz gegenüber Todesrezeptor-vermittelter Apoptose zu erwirken.
2. HepG2-Zellen, welche durch die Histondeacetylasehemmer Apicidin, CBHA, M344 und VPA sowie durch den Methyltransferasehemmer 5-Azacytidine sensitiviert wurden, gingen trotz Caspasehemmung in die Apoptose, welche nur durch gleichzeitige Gabe der Serinproteasehemmer TPCK, TLCK und AEBSF verhindert werden konnte.
3. Die Stimulantien des intrinsischen Signalweges der Apoptose Camptothecin, Staurosporin und UV-Strahlung führten zu einer zeit- und konzentrationsabhängigen Aktivierung von Caspasen, welche zu einem Zelltod mit typisch apoptotischer Morphologie führte. Der Einsatz des Caspasehemmers zVAD-fmk und/oder von Serinproteasehemmern verhinderte weder die Apoptose noch führte er zu einer veränderten Ausprägung.
4. Der allgemeine Caspasehemmer zVAD-fmk hemmte sowohl Initiator- als auch Effektorcaspasen. Weiterhin führte der Einsatz von spezifischen Caspasehemmern zu einer vollständigen Aufhebung der DEVD-Spaltung durch Effektorcaspaseaktivität ohne allerdings die Zellen vor CD95L- und Staurosporin-vermittelter Apoptose zu schützen.
5. Die Freisetzung des Caspase-unabhängigen agierenden proapoptotischen Moleküls AIF aus dem Mitochondrium wurde durch den PARP-Hemmer 3-Aminobenzamid verhindert ohne allerdings die Zellen vor CD95L- und Staurosporin-vermittelter Apoptose zu schützen. Das Muster der oligonucleosomalen DNA-Spaltung ist unter Einfluss von zVAD nicht verändert, wie es üblicherweise in einen AIF-abhängigen Zelltod der Fall wäre.
Die Ergebnisse der Arbeit zeigen, das primäre humane Hepatozyten und HepG2-Zellen nicht durch eine generelle Caspasehemmung vor Apoptose geschützt werden. Es scheint, dass zumindest in der Todesrezeptor-vermittelten Apoptose Serinprotease-abhängige Signalwege existieren, welche parallel zu den Caspase-abhängigen Signalwegen agieren.
Die gegen Neoplasien wirksame Substanz 5-Azacytidin, welche seit kurzem zur Behandlung myelodysplastischer Syndrome zugelassen wurde, ist ein bahnbrechendes Beispiel für Methyltransferasehemmer. Deren pharmakodynamischen Eigenschaften wurden untersucht, um die sensitivierende Wirkung auf Hepatozyten zu charakterisieren.
1. 5-Azacytidin sensitivierte Hepatozyten gegenüber Todesrezeptor-stimulierter Apoptose.
2. In HepG2-Zellen sensitivierte 5-Azacytidin zeit- und konzentrationsabhängig selektiv gegenüber CD95L-und TRAIL-vermittelter Caspaseaktivierung und Apoptose, zeigte aber keine Effekte gegenüber TNF-a.
3. Die sensitivierende Wirkung beruhte nicht auf der Hemmung von Methyltransferasen, da andere bekannte Methyltransferasehemmer wie z.B. das Analogon 5-Aza-2 -deoxycytidin keine sensitivierenden Eigenschaften aufwiesen.
4. In 5-Azacytidin behandelten Zellen wurden die proapoptotischen Proteine p53 und Bax zeit- und konzentrationsabhängig hochreguliert.
5. Nach Rezeptor/DISC unabhängiger Aktivierung des extrinsischen Signalweges durch Überexpression der aktiven Caspase-8, war die Effektorcaspaseaktivität in 5-Azacytidin vorbehandelten Zellen gegenüber Kontrollzellen erhöht.
6. Die Caspaseaktivierung und zytotoxische Wirkung von p53/Bax-abhängigen intrinsischen Stimulantien war nach Sensitivierung mit 5-Azacytidin erhöht.
7. Im Gegensatz dazu war nach künstlicher Aktivierung des intrinsischen Signalweges durch Zugabe von dATP/Cyctochrom C zu einer cytosolischen S-100 Fraktion von 5-Azacytidin vorbehandelten HepG2-Zellen keine Erhöhung der Effektorcaspaseaktivität messbar.
Der Entwurf der Studie beinhaltete primäre humane und murine Hepatozyten wie HepG2-Zellen, um akute Wirkungen von 5-Azacytidin auf die Apoptose zu bestimmen. Die Ergebnisse zeigen, dass 5-Azacytidin Hepatozyten gegenüber Todesrezeptorvermittelte- Apoptose sensitiviert. Als Ursache, werden Beweise für eine p53/Bax-abhängigen Mechanismus vorgestellt, welcher, angesiedelt zwischen DISC und Mitochondrium, zu einer verstärkten Empfindlichkeit gegenüber Apoptose führt. Zusammengefasst geben die Ergebnisse eine ursächliche Begründung für die leberschädigenden Nebenwirkungen von 5-Azacytidin, welche in Patienten mit Lebervorerkrankungen beobachtet wurden.

The present study investigated the role of caspases and serine proteases in hepatocyte apoptosis triggered by death receptor agonists and by stimuli inducing the intrinsic pathway of apoptosis. In addition, the potential of various epigenetic drugs to sensitize towards a serine protease-dependent mechanism of apoptosis under caspase arrest was examined within the HepG2 cell model.
1. In contrast to primary murine hepatocytes, inhibition of caspases by zVAD-fmk was not sufficient to protect primary human hepatocytes and the human hepatoma cell line HepG2 from death receptor agonist-induced apoptosis.
2. HepG2 cells, sensitized towards CD95L- and TRAIL-triggered apoptosis by the histone deacetylase inhibitors apicidin, CBHA, M344 and VPA as well as by the DNA methyltransferase inhibitor 5-azacytidine, were able to undergo apoptosis under caspase arrest, which could only be prevented by additional, simultaneous application of the serine protease inhibitors TPCK, TLCK and AEBSF.
3. The inducers of the intrinsic pathway of apoptosis camptothecin, staurosporine and UV-radiation led to a time- and concentration-dependent activation of caspases resulting in cell death with typical apoptotic morphology in HepG2 cells. However, use of caspase inhibitor zVAD-fmk and/or serine protease inhibitors neither prevented nor changed the morphology of apoptosis.
4. The pan-caspase inhibitor zVAD-fmk is able to inhibit a set of initiator and effector caspases. Furthermore, the application of specific caspase-inhibitors abolished DEVD cleavage-activity but failed to protect HepG2 cells from CD95L and staurosporine induced apoptosis.
5. The release of the caspase-independent proapoptotic molecule AIF from the mitochondria was prevented by application of PARP inhibitor 3 aminobenzamid without protecting HepG2 cells from apoptosis. Additionally, under caspase arrest the pattern of oligonucleosomal DNA fragmentation is not altered as commonly observed under sole influence of AIF.
The results of this thesis demonstrate that a general caspase inhibition does not protect human primary hepatocytes and HepG2 cells from apoptosis. As mechanistic rationale a serine protease-dependent pathway acting in parallel to caspase signaling can be provided, at least for death receptor agonist-induced apoptosis.
The antineoplastic agent 5-azacytidine is a pioneering example of DNA methyltransferase inhibitors, which was recently approved for treatment of myelodysplastic syndromes. The pharmacodynamic properties of 5-azacytidine were elucidated to profile the newfound sensitizing effect on hepatocyte apoptosis. In summary, following results were obtained:
1. 5-Azacytidine sensitized hepatocytes towards death receptor agonist-induced apoptosis.
2. Treatment with 5-azacytidine selectively caused a time- and concentration-dependent sensitization towards CD95L- and TRAIL-triggered caspase-activation and apoptosis, but exerts no effect with TNF-a in HepG2 cells.
3. Sensitization capability of 5-azacytidine is not primarily based on its inhibitory effect on DNA methyltransferases as other common used inhibitors like the analogue 5-aza-2 -deoxycytidine exert no sensitization effects on hepatocytes.
4. After exposure to HepG2 cells, 5-azacytidine induced a time- and concentration- dependent upregulation of the proapoptotic proteins p53 and Bax.
5. 5-Azacytidine enhanced effector caspase activity when the extrinsic pathway of apoptosis was activated without DISC contribution by transient overexpression of caspase-8.
6. Caspase activity and cytotoxicity of p53/Bax-dependent intrinsic stimuli was enhanced by 5-azacytidine
7. In contrast, artificial activation of the intrinsic pathway within S-100 cytosolic fractions of HepG2 via dATP/cytochrom c failed to induce upregulation of caspase activity after 5-azacytidine treatment.
The design of this study comprised malignantly transformed liver cells, primary mouse and human primary hepatocytes to detect acute effects of 5-azacytidine on apoptosis. The results obtained reveal that 5-azacytidine sensitizes hepatocytes against death receptor agonists. As a mechanistic rationale, evidence for a p53/Bax-dependent sensitizing mechanism acting in-between the death inducing signaling complex (DISC) and above the mitochondrial level were presented. In summary, the findings offer a mechanistic explanation for the adverse hepatotoxic properties of 5-azacytidine observed in patients with pre-existing liver disorders.