Substanzen, die Etherfunktionen enthalten, sind in der Umwelt weit verbreitet, dazu zählen Ether aus natürlichen Quellen, wie Methylether, Glycerolipide und das Polymer Lignin, oder xenobiotische Chemikalien wie Polyethylenglycole, diverse Detergentien und viele Agrochemikalien. Erfahrungsgemäß werden Etherverbindungen in der Natur relativ schlecht abgebaut (White et al., 1996). Unter oxischen Bedingungen erfolgt eine Ether-Spaltung gewöhnlich durch Oxygenasen, die eines der Kohlenstoffatome der Etherbrücke hydroxylieren, sodass dadurch Halbacetale bzw. Halbketale entstehen. Diese instabilen Zwischenstufen zerfallen in wässrigen Lösungen zu Alkohol und Aldehyd bzw. Keton. Enzyme, die Ether unter anoxischen Verhältnissen spalten können, sind dagegen kaum untersucht.
Der Organismus Acetobacterium Stamm LuPhet 1 wurde als Vertreter der verschiedenen anaeroben PEG-Verwerter ausgesucht, weil er außerdem den Monoether 2‑Phenoxyethanol spalten kann, zu Phenol und Acetaldehyd. Das entsprechende Enzym wurde als Phenoxyethanol-Acetaldehyd-Lyase bezeichnet. Des weiteren katalysiert Acetobacterium Stamm LuPhet 1 die Dehydratisierung von vicinalen Diolen wie Ethylenglycol, ebenfalls unter Bildung der Aldehyde (Frings und Schink, 1994).
In der vorliegenden Arbeit zeigte sich in Übereinstimmung mit den früheren Arbeiten, dass die Dehydratisierung von vicinalen Diolen wie Ethylenglycol durch ein Coenzym-B12-abhängiges Enzym katalysiert wurde, das den bekannten Coenzym-B12-abhängigen Diol-Dehydratasen (EC 4.2.1.28 bzw. EC 4.2.1.30) ähnlich ist. Bei den Enzymen für Diol-Dehydratisierung bzw. Phenoxyethanol-Spaltung handelte es sich um voneinander unabhängige Enzyme, letzte Zweifel an ihrer Verschiedenheit wurden ausgeräumt. Die Kernfragen der Arbeit lauteten somit: Wie sieht der Mechanismus der Phenoxyethanol-Spaltung von Acetobacterium Stamm LuPhet 1 aus? Wie wird dieses nicht-aktivierte Substrat angegriffen? Von welchen Cofaktoren ist das Enzym abhängig?
Alle Untersuchungen der vorliegenden Arbeit wurden mit ganzen Zellen oder mit Zellextrakt von Acetobacterium Stamm LuPhet 1 durchgeführt. Die Phenoxyethanol-Acetaldehyd-Lyase war bei allen getesteten Kultursubstraten induziert. Die Enzymaktivität der Phenoxyethanol-Acetaldehyd-Lyase war sehr sauerstoffempfindlich. In ehemals oxischen Ansätzen konnte sie durch Zugabe von Reduktionsmittel (Titancitrat) nicht wieder hergestellt werden. Der Zusatz des Reduktionsmittels Titan(III)citrat war wichtig, er sorgte für höhere Aktivität bzw. besseren Erhalt der Aktivität. Dagegen wirkten reduzierenden Schwefelverbindungen (Dithionit, Dithiothreitol bzw. Hydrogensulfid) in millimolaren Konzentrationen (jeweils zusätzlich zu 2,5 mM Titancitrat) schädlich. Für die Phenoxyethanol-Spaltung wurden mit ganzen Zellen Anfangsaktivitäten von ca. 5‑10 U/mg Protein, mit zellfreiem Extrakt oft von ca. 1 U/mg Protein erhalten; letzteres ist deutlich mehr als zuvor für Extrakt berichtet wurde (Frings und Schink, 1994). Die Umsatzrate verringerte sich aber nach der Substratzugabe kontinuierlich, sodass bei zellfreiem Extrakt nach maximal 3,5 min kein weiterer Umsatz mehr stattfand. Bei ganzen Zellen nahm die Aktivität während der ersten ca. 1-3 min ebenfalls ab, danach jedoch wurde die weitere Umsetzung mit einer gleichbleibenden Aktivität, die etwa der in-vivo-Aktivität von 1 U/mg Protein entsprach, fortgesetzt. Daraus wurde gefolgert, dass die Phenoxyethanol-Acetaldehyd-Lyase nach einer bestimmten Zahl von Zyklen aus dem Kreislauf ausscheidet (Inaktivierung), und dass dies bei ganzen Zellen durch eine kontinuierliche Rückführung von inaktivierter Lyase in den Katalysekreislauf (Reaktivierung) aufgefangen wird. Die Phenoxyethanol-Acetaldehyd-Lyase war im Cytosol lokalisiert und weder abhängig von Coenzym B12 noch gab es Hinweise auf eine Abhängigkeit von anderen schwach gebundenen Cofaktoren. Im Rahmen einer Kooperation wurden Mechanismus-Untersuchungen mit Hilfe von 2H- und 13C-markierten Phenoxyethanolen durchgeführt. Um die Ergebnisse erklären zu können, die mit den markierten Phenoxyethanolen in Zellsuspensionen erhalten wurden, kommen vor allem radikalische Enzym-Mechanismen in Frage. Es wurden Mechanismen vorgeschlagen, die ähnlich dem Mechanismus der Coenzym-B12-abhängigen Dehydratasen jeweils mit der Abstraktion eines Wasserstoffatoms von C-1 des Substrats beginnen, dabei jedoch nicht über ein 5´-Desoxyadenosylradikal sondern über ein anderes Radikal ablaufen. Die postulierten Reaktionswege beinhalten eine Umlagerung des Substratradikals und nachfolgende Halbacetalbildung (analog den B12-Dehydratasen, wobei allerdings nicht das Hydroxid sondern das Phenoxid wandert) (Weg I) bzw. eine Abspaltung von Phenolat direkt aus dem Substratradikal, ohne vorherige Umlagerung und Halbacetalbildung (Weg II).
Das Auftreten von Inaktivieren und Reaktivieren zusammen mit den Befunden mit 2H- und 13C-markiertem Phenoxyethanol und die anderen Ergebnisse wie die Unabhängigkeit von Coenzymen und die Empfindlichkeit gegenüber Sauerstoff bzw. reduzierenden Schwefelverbindungen, passen gut zu einem Mechanismus, der durch ein Proteinradikal (z. B. ein Glycyl- bzw. Thiylradikal) eingeleitet wird. Insgesamt sprechen die verschiedenen Ergebnisse dafür, dass die Phenoxyethanol-Acetaldehyd-Lyase zur Gruppe der Glycylradikalenzyme gehört. Dementsprechend enthält Acetobacterium Stamm LuPhet 1 vermutlich auch ein SAM-abhängiges Aktivierungsenzym zur Aktivierung der Phenoxyethanol-Acetaldehyd-Lyase.

Substances that contain ether functional groups are widespread in the environment. They originate from natural sources such as methylethers, glycerolipids, and the natural polymer lignin or from xenobiotic sources such as diverse agrochemicals, polyethylene glycols, and detergents. The cleavage of ether bonds is a chemically difficult step. Likewise the biodegradation of ether substances is a relatively slow process (White et al., 1996). Aerobic organisms usually hydroxylate one of the carbon atoms of the ether function via oxygenases, the resulting hemiacetals or hemiketals are instable in aqueous solution and disintegrate to alcohol and aldehyde or ketone. From anaerobic organisms only few ether cleaving enzymes have been characterized so far.
Acetobacterium strain LuPhet 1 was chosen among the anaerobic PEG-utilizing bacteria because it additionally is able to cleave the monoether 2-phenoxyethanol to phenol and acetaldehyde. The corresponding enzyme was called phenoxyethanol-acetaldehyde-lyase. Acetobacterium strain LuPhet 1 additionaly dehydrates vicinal diols such as ethylene glycol to the corresponding aldehyde (Frings and Schink, 1994).
In the work presented here it was shown in accordance with former studies that the dehydration of diols such as ethylene glycol was catalyzed by a coenzym B12-dependent enzyme, similar to the known coenzyme B12-dependent diol dehydratases (EC 4.2.1.28 and EC 4.2.1.30), however, the enzymes responsible for the dehydration of vicinal diols and the cleavage of 2-phenoxyethanol are two independent enzymes, last doubts about their difference could be removed in this study. Thus, the key questions of this thesis posed as follows: What is the mechanism of the cleavage of 2-phenoxyethanol of Acetobacterium strain LuPhet 1? How is this non-activated substrate attacked? Which cofactors does the enzyme depend on? All experiments were run with intact cells or cell extract of Acetobacterium strain LuPhet 1. It showed that the ability to cleave 2-phenoxyethanol was induced by all growth substrates tested. The enzyme activity of the phenoxyethanol-cleavage was very sensitive towards oxygen. This is why the presence of the reducing agent titanium(III)citrate was important to preserve the activity, while after once having been in contact with oxygen the activity could not be restored by adding titanium citrate. The reducing sulfur substances in millimolar concentrations additionally to 2.5 mM Ti(III)citrate (dithionite, dithiothreitol bzw. hydrogensulfide) had negative effects. For the cleavage of phenoxyethanol in whole cells initial activities of about 5-10 U/mg protein and in cellfree extracts of about 1 U/mg protein could be measured, the latter is much more than formerly reported for extract (Frings and Schink, 1994). After adding the substrate the turnover rate diminished constantly in such a way that with cellfree extract after at most 3.5 min no further conversion took place. With whole cells the activity decreased during the first 1-3 min as well, but then the turnover reached a constant rate resembling the in-vivo-activity of 1 U/mg protein. It was concluded that the phenoxyethanol-acetaldehyde-lyase drops out of the catalytic cycle after a certain number of catalyzed reactions (inactivation) and that in whole cells this is cushioned by continuous restoration of inactivated lyase (re-activation). The phenoxyethanol-acetaldehyde-lyase was localized in the cytosol and was neither dependent on coenzyme B12 nor were there indications on the dependence on other weakly bound cofactors.
Studies on the mechanism by means of 2H- und 13C-labeled phenoxyethanol were realized within a cooperation. To explain the results obtained with cell suspensions converting the labeled phenoxyethanol essentially enzyme mechanisms involving radical intermediates come into question. The proposed mechanism resembles the mechanism of B12-diol dehydratase because a hydrogen atom is abstracted from C-1 of the substrate, but it differs in that it is initiated by another radical than the 5 -deoxyadenosyl radical. The postulated reaction pathways involve the rearrangement of the substrate radical and subsequent formation of a hemiacetal (analoguous to the B12-diol dehydratases, but with the phenoxide wandering instead of the hydroxide) (pathway I) or the breaking of the phenolate directly off the substrate radical (without a preceding rearrangement) and formation of a hemiacetal (pathway II).
The occurrence of inactivation and re-activation together with the findings obtained with the labeled phenoxyethanols and the other results like the independence of coenzymes and the sensitivity towards oxygen as well as towards reducing sulfur substances are compatible with a mechanism initiated by a protein radical (for example a glycyl radical or a thiyl radical). Altogether the different results point to the phenoxyethanol-acetaldehyde-lyase belonging to the growing group of the glycyl radical enzymes. In that case, like other glycyl radical enzymes, it would probably possess a corresponding SAM-dependent activating enzyme.