Molekulargenetische Untersuchungen zur Differenzierung von Trypanosoma brucei
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Potential mediators of the cAMP signal transduction pathway were analyzed with respect to their role during differentiation of Trypanosoma brucei 'long slender' to 'short stumpy' bloodstream forms (BSF). Three isoforms of the catalytic subunit of PKA were already known in T. brucei. A regulatory subunit of PKA (PKAR) was cloned and characterized. PKAR seems to be the only regulatory subunit in T. brucei. Its mRNA and protein are differentially expressed during the life cycle of T. brucei. Cloning of PKAR allowed for the first time to demonstrate the existence of a PKA holoenzyme in T. brucei. However the holoenzyme could neither in vitro nor in vivo be dissociated by cAMP. Deletion and overexpression experiments were used to analyze the function of PKAC3, a catalytic isoform of PKA. PKAC3 has a stagespecific function and the three catalytic isoforms of PKA are non-redundant in BSF. Furthermore it could be excluded that differentiation is exclusively induced by PKAC3. PKAR was mutated in both cAMP binding sites and expressed in parallel with wildtype (wt) PKAR in BSF. In addition a mammalian cAMP-resistant regulatory subunit was expressed. However only the overexpression of wt PKAR influenced growth of T. brucei BSF. In a general screen for protein kinases involved in differentiation of T. brucei BSF, PK4, a serine threonine kinase was deleted in BSF. Results in two strains indicated an essential role for PK4 in bloodstream forms.
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In dieser Arbeit wurde die Beteiligung möglicher Effektoren des cAMP-Signaltransduktionsweges an der Differenzierung von Trypanosoma brucei 'long slender'- zu 'short stumpy'- Blutstromformen (BSF) untersucht. Drei Isoformen der katalytischen Untereinheit der cAMP-abhängigen Proteinkinase (PKA) waren in T. brucei bereits bekannt. Die regulatorische Untereinheit (PKAR) der PKA wurde kloniert und charakterisiert. Sehr wahrscheinlich ist die PKAR die einzige regulatorische Untereinheit der PKA in T. brucei. Sowohl die mRNA als auch das Protein werden in 'long slender' BSF stärker exprimiert als in 'short stumpy' und prozyklischen Zellen. Durch die Klonierung der PKAR wurde zum erstenmal gezeigt, daß ein PKA-Holoenzym in T. brucei vorliegt. Der Holoenzym-Komplex konnte weder in vitro mit cAMP, noch durch Inkubation der Zellen mit einem membrangängigen cAMP-Derivat aufgelöst werden. Die Funktion der PKAC3, eine der drei Isoformen der katalytischen Untereinheit der PKA in T. brucei, wurde durch Deletion und Überexpression analysiert. Die Versuche ergaben, daß die PKAC3 eine stadienspezifische Funktion hat, und daß die Funktion der drei katalytischen Isoformen der PKA in BSF nicht redundant ist. Ebenso konnte ausgeschlossen werden, daß die Differenzierung allein durch diese Kinase induziert wird. Eine an beiden cAMP-Bindungsstellen mutierte PKAR und die Wildtyp PKAR sowie eine mutierte cAMP-resistente regulatorische Untereinheit aus Säugerzellen wurden in T. brucei BSF exprimiert. Die starke Überexpression der Wildtyp PKAR hatte, im Gegesatz zur Expression der mutierten PKAR und der cAMP-resistenten regulatorischen Untereinheit aus Säugerzellen, einen Effekt auf das Wachstum von BSF. Im Rahmen einer allgemeinen Analyse von Proteinkinasen, die potentiell an der Differenzierung in Trypanosoma brucei beteiligt sein könnten, wurde die Serin/Threonin Kinase PK4 in BSF deletiert. Die Ergebnisse aus zwei Stämmen legten nahe, daß die PK4 ein essentielles Gen in BSF ist.
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ISO 690
SCHULTE SODINGEN, Cordula, 2000. Molekulargenetische Untersuchungen zur Differenzierung von Trypanosoma brucei [Dissertation]. Konstanz: University of KonstanzBibTex
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