In der vorliegenden Arbeit wurde die Expression von sog. Non-Rezeptor Protein-Tyrosinphosphatasen in Lymphocyten ("Splenocyten") untersucht. Mit Hilfe von RT-PCR-Strategien wurden DNA-Sequenzen amplifiziert, die u.a. für verschiedene PTP des Schweins codierten. Folgende Enzyme wurden hierbei in Vektoren kloniert: Tc-PTP, PTP1B, PTP1C, PTP1D, PKA. Die PTP1C und PTP1D gehören zur Unterfamilie der SH2-PTPs, die Phosphatasen der PTP1B/Tc-PTP-Unterfamilie weisen einen hydrophoben Bereich im CT auf und sind weitgehend Membrangebundene Enzyme, die an das ER gekoppelt bzw. im Zellkern lokalisiert sind.
Die Sequenzierung der PTP-Klone ergab eine hohe Identität (~96 % bei PTP1C und ~99 % bei PTP1D) der Aminosäure-Sequenzen der beiden SH2-PTPs des Hausschweins gegenüber den entsprechenden humanen PTP. Die Sequenzen von Tc-PTP von Schwein und Mensch sind zu ca. 92 % identisch, während die Sequenzen der PTP1B etwas geringere Identitäten von ca. 86 % aufweisen. Die Sequenz der PTP1B des Schweins zeigt im Vergleich zur humanen Sequenz eine Deletion von 8 AS in der Prolin-reichen Sequenz des CT, zwischen G376 und A385 der Human-PTP1B. Weiter, in Richtung CT, liegt bei der PTP1B vom Schwein eine weitere Pro-reiche Sequenz vor (ab P392 in der Human-PTP1B), die in der Human-PTP1B nicht vorkommt.
Die Expression der PTP1B und Tc-PTP in kultivierten Splenocyten wurde mit Hilfe von RT-PCR analysiert. LPS erzeugte eine deutliche Erhöhung der mRNA für Tc-PTP nach ca. 6 Stunden, was auf eine erhöhte Gen-Expression zurück zu führen sein könnte. Die Tc-PTP zeigt nach kurzer Zeit (1,5 h) eine Konzentrations-abhängige Erhöhung der mRNA unter H2O2-Exposition der Lymphocyten. Verschiedene chemische Behandlungen (Stimulierung mit IL-6, IL-4, IFNg, und N-Acetylcystein; NAC) von kultivierten Splenocyten beeinflussten gegenseitig die Expression der Tc-PTP und PTP1B. Die Ergebnisse zeigen, daß der Redox-Zustand in Splenocyten eine wichtige Rolle bei der Expressionsregulation der PTP1B und Tc-PTP spielen könnte.
Die Expression der Phosphatasen PTP1B/Tc-PTP wurde mit Northern-Blots anhand der mRNA aus isolierten T-Splenocyten untersucht. Für Tc-PTP zeigte sich eine deutliche und konzentrationsabhängige Erhöhung der mRNA nach ConA Behandlung, nicht aber für die PTP1B. Salicylsäure (SS) und NAC verringerten die Menge der mRNA der Tc-PTP in T-Splenocyten. Diese Beobachtung weist möglicherweise auf eine Beteiligung des Transkriptionsfaktors NF-kB bei der Signaltransduktion hin, welche die Genexpression der Tc-PTP in T-Zellen kontrolliert. SS konnte jedoch die Zunahme der Expression, die durch ConA induziert worden war, nicht verringern, was wiederum ein Indikator dafür sein könnte, dass ConA in T-Zellen nicht auf Signalwege wirkt, die NF-kB aktivieren. Diese Ergebnisse weisen auf eine Vernetzung verschiedener Signalübertragungswege hin, welche die Genexpression der Tc-PTP in T-Zellen Steuern und sie weisen auch darauf hin, dass die beiden Gene für die Phosphatasen der PTP1B/Tc-PTP Unterfamilie getrennt von einander reguliert werden. Die Enzyme dieser Unterfamilie könnten unterschiedliche Rollen bei der Proliferation der Lymphocyten oder Aktivierung von T-Zellen spielen.
Änderungen in der Konzentration von Protein Tyrosinphoshatasen wurden in isolierten T-Lymphocyten aus der Milz in Anwesenheit von Ionophoren und Immunsupressoren mit Hilfe von Western-Blotting untersucht. In Milz T-Lymphocyten verursachten Ca2+ Ionophore (nach 20 h Anwesenheit von Ionomycin und A23187) eine Abnahme der Tc-PTP und in geringerem Ausmaß der PTP1B und PTP1D, aber ohne klaren Effekt auf die Menge der PTP1C und der Rezeptor-Tyrosinphosphatase CD45. Die Immunsupressoren Cyclosporin A, FK-506 und Rapamycin induzierten eine Zunahme der Tc-PTP in T-Splenocyten, die durch beide Ionophore gehemmt wurde. Die PTPs CD45 und PTP1C zeigten keine Änderungen der Protein-Konzentration in T-Lymphocyten nach Behandlung mit Immunsupressoren oder Ionophoren. Die Ergebnisse könnten auf einen "cross-talk" verschiedener Signalübertragungswege hinweisen, weil der aktivierende-Effekt von Immunsupressoren auf die Tc-PTP Expression durch Ionophoren gehemmt wurde. Die aktivierende Wirkung von Immunsupressoren auf die Konzentrationen von Tc-PTP in T-Lymphocyten könnte eine weitere Erklärungsmöglichkeit ihrer Wirkung über die festgestellte hemmende Wirkung von Tc-PTP auf die Aktivierung von T-Zellen eröffnen.

In the present work the expression of non-receptor protein tyrosine-phosphatases (PTPs) in pig spleen lymphocytes (splenocytes) was examinated. With the help of RT-PCR - strategies DNA sequences were amplified, including those for various cytoplasmatic PTPs of the pig. The following enzymes have been cloned and sequenced: Tc-PTP, PTP1B, PTP1C, PTP1D, as well as the cAMP dependent protein kinase PKA. PTP1C and PTP1D belong to the subfamily of SH2-PTPs; the phosphatases PTP1B/Tc-PTP- subfamily have a hydrophobic tail in the CT and are largely membrane-linked enzymes (ER-bound or translocated into the nucleus).
Pig PTPs showed high identity on their aminoacid sequences for both SH2-PTPs (~ 96% for PTP1C and ~ 99% for PTP1D) compared with the corresponding human PTP. The sequences of Tc-PTP from pig and human are approximately 92% identical, while the PTP1B-sequences showed lower identity, of about 86%. The porcine PTP1B shows in comparison to the human gene a deletion of 8 aminoacids in the proline-rich sequence of the CT, between G376 and A385 in the human PTP1B. The swine PTP1B shows another Pro-rich sequence at the CT (up from P392 in human PTP1B), which is absent in the human PTP1B.
The expression of PTP1B and Tc-PTP in cultured splenocytes was investigated by RT-PCR. LPS produced a significant mRNA-increase of Tc-PTP after about 6 hours, suggesting an increased gene expression and/or an increased mRNA stability. The Tc-PTP shows after a short period (1.5 h) a concentration-dependent increase of mRNA after H2O2-exposure of cultured pig spleen lymphocytes. Various chemical treatments (stimulation with IL-6, IL-4, IFNg, and N-acetylcysteine, NAC) of cultured splenocytes induced different expression degrees of Tc-PTP and PTP1B, in an opposite form for both enzymes. The results also show that the redox status of splenocytes would play an important role in the regulation of the expression of PTPs 1B and Tc-PTP.
The gene expression of cytoplasmatic PTPs has also been investigated on isolated spleen lymphocytes, in order to obtain a specific T-cell response after mitogenic stimuli of primary cultured cells. The splenocytes were purified by centrifugation in Percoll-PBS gradients and thus separated into different subpopulations of lymphocytes. The expression of the phosphatases PTP1B/Tc-PTP in Northern blots using isolated T-splenocytes was investigated. Tc-PTP showed a significant and concentration-dependent increase of mRNA after treatment of cells with ConcanavalinA (ConA), but not for PTP1B. Salicylic acid (SS) and NAC decreased the amount of mRNA of Tc-PTP in T-Splenocyten. This observation points to a possible involvement of the transcription factor NF-kB in the signal transduction pathway that controls the gene expression of Tc-PTP in T cells. However, the ConA-induced increase in the Tc-PTP expression in T-splenocytes was not reverted by different concentrations of SS. These results suggest a "cross talk" of different signaling pathways which regulate the gene expression of Tc-PTP in T cells; they also point out that these two PTP-genes (PTP1B/Tc-PTP) possess different biochemical mechanisms of control of it gene expression. Both enzymes could have different (opposite, complementary, but not redundant) roles during the proliferation/activation of lymphocytes.
Changes in the protein concentration of PTPs in isolated T-lymphocytes from pig spleen was investigated by Western blotting, after treatment of cells with Ca2+-ionophores and immunesupressors. Ca2+ ionophores (after 20 h of exposure to Ionomycin and A23187, in the micromolar range) induced in cultured pig T-lymphocytes a decrease in Tc-PTP and, to a lesser extent, of PTP1B and PTP1D, but without a clear effect on the amount of PTP1C and the receptor-tyrosine-phosphatase CD45. The immunesupressors cyclosporin A, FK-506 and rapamycin (concentrations in the micromolar range) induced an increase in Tc-PTP concentration in T-splenocytes. The PTPs CD45 and PTP1C showed no significant changes in their protein concentration in T-lymphocytes after treatment with immunesupressors. The results could indicate again the participation of different signaling pathways upon the control of the expression of Tc-PTP, because the activating effect of immunesupressors on the Tc-PTP cellular content, was reverted by ionophores. The activatory effect of immunesupressors on the cellular concentration of Tc-PTP in T-lymphocytes opens a further explanation of their molecular mechanisms of action inhibiting T-cell activation, given the known inhibitory role of Tc-PTP in the activation of T cells.