Startstellen der DNA-Replikation und Bindestellen des 'Origin Recognition Complex' im Humangenom
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The first part investigated the temporal and spatial control of the initiation of DNA replication in a human cell free system. I showed that the lamin B2 origin is activated upon entry of the cells into S-phase whereas the rDNA origin is active through progression of mid S-phase. The date present evidence for a spatial and temporal control of replication initiation in human cells that is maintained from one cell cycle to the next. The second part investigated human origin recogntion complex (ORC) proteins which are key player in the initiation of DNA replication. I showed that all six subunits reside at same chromatin sites in vivo. A new version of the chromatin immunoprecipitation assay in combination with quantitative real-time PCR was used for the identification of ORC binding sites in the human genome. A ORC binding site is located close to transcription factor SP1 binding sites in the human TOP1 gene promoter. The region contains two matrix attachment region and the promoter is located within a CpG island. By nascent DNA strand analyses using quantitative real-time PCR it was demonstrated that the ORC binding site coincide with an active of origin of bidirectional DNA replication. ORC was also found to be bound to heterochromatic regions of alphoid satellite DNA which, however, did not serve as a replication origin. This suggests that ORC may have additional functions in heterochromatin despite its role in DNA replication.
Zusammenfassung in einer weiteren Sprache
Im ersten Teil dieser Arbeit wurde zum ersten Mal gezeigt, dass in einem humanen zellfreien System, die DNA-Replikation in isolierten Zellkernen spezifisch an Origin-Sequenzen eingeleitet wird. Die präsentierten Daten verdeutlichen, dass die Initiation der DNA-Replikation in einer zeitlich festgelegten Reihenfolge abläuft. So wird der Lamin B2 Origin zu einem frühen Zeitpunkt in der S-Phase aktiviert, während der rDNA Locus erst in der mittleren S-Phase zu replizieren beginnt.
Im zweiten Teil der Arbeit habe ich gezeigt, dass die sechs ORC-Proteine an das Chromatin, vermutlich an denselben Chromatin-Stellen gebunden sind, was ein weiterer wichtiger Hinweis auf eine Komplexbildung in vivo ist.
Ein wesentlicher Punkt dieser Arbeit hat in der Identifizierung von Bindestellen des Origin Recognition Complex (ORC) im Humangenom gelegen. Hier konnte ich zeigen, dass ORC innerhalb einer CpG-Insel des TOP1 Gen Promotors in enger Assoziation mit den SP1-Bindestellen gebunden ist. Weiterhin habe ich demonstriert, dass die gleiche Region mit einer aktiven Startstelle der DNA-Replikation co-lokalisiert und somit zum ersten Mal einen funktionellen Zusammenhang zwischen der Bindung von ORC und einem Replikationsstartpunkt in menschlichen Zellen hergestellt.
Schließlich wurde eine Bindung von ORC in heterochromatischen Chromatinbereichen nachgewiesen, was darauf hindeutet, dass ORC-Proteine auch bei der Organisation des Chromatins eine wichtige Rolle spielen und auf diese Weise die DNA-Replikation und weitere zelluläre Prozesse steuern.
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ISO 690
KELLER, Christian, 2002. Startstellen der DNA-Replikation und Bindestellen des 'Origin Recognition Complex' im Humangenom [Dissertation]. Konstanz: University of KonstanzBibTex
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