A three-step enzyme cascade carries out the covalent conjugation of ubiquitin to target proteins. The formation of an isopeptide bond between ubiquitin and a lysine residue in a substrate requires the activation of the C-terminal glycine residue of ubiquitin by an activating enzyme (E1), which first adenylates ubiquitin and then transfers it onto its active site cysteine to form a thioester bond. The activated ubiquitin is subsequently passed onto a cysteine in the active site of a ubiquitin-conjugating enzyme (E2). The ubiquitin-charged E2 enzyme and a specific substrate protein are then both bound by a ubiquitin protein ligase (E3), which catalyzes the transfer of the activated ubiquitin onto the substrate protein. This system was thought to be arranged in a hierarchal way with one E1, dozens of E2 enzymes and hundreds of E3 enzymes. The mechanism of conjugation not only applies to ubiquitin but also to the family of ubiquitin-like modifiers like ISG15, NEDD8 and SUMO. For the IFN-γ and TNF-α inducible modifier FAT10 no enzyme cascade has been characterized, even though it is known that FAT10 and its conjugates are rapidly degraded by the proteasome, which can be enhanced by the interaction of NUB1L.
The aim of this thesis was the characterization of the FAT10 conjugation pathway, starting with the identification of novel activating enzymes. The identification of the so far elusive FAT10 conjugate in a murine fibroblast cell line was another aim of this study.
During the course of experiments for the search of a new activating enzyme, UBA6 (UBE1L2) was identified as a second ubiquitin-activating enzyme, which can substitute for UBE1 in ubiquitylation assays with UBCH5B as E2 enzyme and E6-AP and HECTH9 as E3 enzymes. Furthermore, the MDM2-mediated ubiquitylation of p53 can occur, when UBE1 is replaced by UBA6. UBA6 mRNA is up-regulated in testes of mice, indicating an organ-specific function. Other well-known E1 enzymes were tested negative for the activation of the ubiquitin-like modifier FAT10. UBA6 turned out to interact with FAT10 in a yeast two-hybrid screen, which encouraged us to exchange the tags on HA-UBA6 and GST-FAT10 to GST-UBA6 and HA-FAT10 in GST pulldown assays. Under these conditions UBA6 could be shown to activate not only ubiquitin but also FAT10.
The UBA6-specific E2 enzyme USE1 could interact with FAT10 by a yeast two-hybrid screening. UBA6-activated FAT10 can be transferred onto USE1 in vitro and in vivo, leading to the formation of covalent conjugates. This was achieved by auto-FAT10ylation of USE1 in cis but not in trans. siRNA mediated down-regulation of USE1 mRNA resulted in a reduction of FAT10 conjugate formation suggesting that USE1 is an important E2 enzyme in the FAT10 conjugation cascade. The co-expression of FAT10 and NUB1L led to the degradation of the USE1-FAT10 conjugate by the proteasome pointing to a negative self-regulation by the auto-modification of USE1 with FAT10.
This thesis further showed that the protein linked to FAT10 in a stably transfected murine fibroblast cell line was identified as a fragment of the SV40 large T antigen. Peptides from the mass-spectrometric analysis revealed that the fragment linked to FAT10 mainly consists of the DNA binding domain of the large T antigen. A monoclonal antibody against the N-terminal 59 amino acids of large T did not recognize the conjugate indicating that also an N-terminal part is missing. The large T fragment did not bind to the FAT10 mutant, which lacks the diglycine motif.
In conclusion, the results presented in this thesis identify a second ubiquitin-activating enzyme and provide insight into the conjugation pathway of FAT10. Furthermore, they strengthen the role of FAT10 in substrate degradation and reveal an auto-regulatory process for FAT10 attachment with the help of NUB1L. The findings provide useful tools to identify FAT10 substrates and to elucidate the physiological role of FAT10 in the immune response in the future.

Die kovalente Konjugierung von Ubiquitin an Zielproteine wird durch eine Drei-Schritt Enzymkaskade durchgeführt. Die Bildung einer Isopeptidbindung zwischen Ubiquitin und einem Lysin des Substrats erfordert die Aktivierung des C-terminalen Glycinrests von Ubiquitin durch ein aktivierendes Enzym (E1), das zuerst Ubiquitin adenyliert und es dann auf das Cystein im aktiven Zentrum überträgt, um eine Thioester-Bindung zu bilden. Das aktivierte Ubiquitin wird danach auf das Cystein des aktiven Zentrums eines Ubiquitin-konjugierenden Enzyms (E2) weitergegeben. Das Ubiquitin-beladene E2 und ein spezifisches Substratprotein werden dann von einer Ubiquitin Proteinligase (E3) gebunden, die den Transfer des aktivierten Ubiquitins auf das Zielprotein katalysiert. Bisher vermutete man, dass dieses System in einer hierarchischen Weise aufgebaut ist, mit einem einzigen E1, dutzenden von E2s und hunderten von E3s. Der Konjugierungsmechanismus trifft nicht nur auf Ubiquitin zu, sondern auch auf die Familie der Ubiquitin-ähnliche Proteine, wie ISG15, NEDD8 and SUMO. Für das IFN-γ und TNF-α induzierbare Ubiquitin-ähnliche Protein FAT10 wurden bisher keine Enzymekaskade charakterisiert, obwohl bekannt ist, dass FAT10 und seine Konjugate schnell vom Proteasom abgebaut werden, was noch durch die Interaktion mit NUB1L beschleunigt werden kann.
Das Ziel dieser Doktorarbeit war die Charakterisierung des Konjugierungswegs von FAT10, beginnend mit der Identifizierung neuer aktivierender Enzyme. Ein weiteres Ziel war es, das FAT10 Konjugat einer murinen Fibroblastenzellline zu identifizieren.
Während der Suche eines neuen, aktivierenden Enzyms, wurde UBA6 (UBE1L2) als zweites Ubiquitin-aktivierendes Enzym identifiziert, das in Ubiquitylierungsassays UBE1 ersetzen kann, sodass Ubiquitin auf das E2 Enzym UBCH5B und anschließend auf die E3 Enzyme E6-AP und HECTH9 übertragen werden kann. Weiterhin kann MDM2-vermittelte Ubiquitylierung von p53 stattfinden, wenn UBE1 von UBA6 vertreten wird. UBA6 mRNA ist in den Hoden der Maus hochreguliert, was auf eine organ-spezifische Funktion hindeuten könnte. Die anderen schon bekannten E1 Enzyme wurden auf die Aktivierung von FAT10 negativ getestet. In einem Hefe-Zwei-Hybrid Test interagierte UBA6 allerdings mit FAT10. Der Austausch der Markierungen von HA-UBA6 und GST-FAT10 zu GST-UBA6 und HA-FAT10 in in vitro Interaktionstests ermöglichte daraufhin nicht nur die Aktivierung von Ubiquitin sondern auch von FAT10.
Das UBA6-spezifische E2 Enzym USE1 interagierte mit FAT10 in einem Hefe-Zwei-Hybrid Interaktionsverfahren. UBA6-aktiviertes FAT10 kann auf USE1 in vitro und in vivo übertragen werden, was zu der Bildung eines kovalenten Konjugats führte. Diese stabile Bindung wurde durch Auto-FAT10ylierung von USE1 in cis, hingegen nicht in trans erreicht. siRNA-vermittelte Runterregulierung von USE1 mRNA führte zur Reduktion der FAT10-Konjugatbildung, was die Annahme zulässt, dass USE1 ein wichtiges E2 Enzym in der FAT10-Konjugierungskaskade ist. Die Ko-Expression von FAT10 und NUB1L führte zum Abbau des USE1-FAT10 Konjugats durch das Proteasom und deutet auf eine negative Selbstregulation durch Automodifikation von USE1 mit FAT10 hin.
Diese Doktorarbeit zeigte weiterhin, dass das Protein, das in einer stabil transfizierten murinen Fibroblastenzellline an FAT10 gebunden war, als ein Fragment des SV40 großen T Antigens identifiziert wurde. Peptide der massenspektrometrischen Analyse zeigten, dass das FAT10-gebundene Fragment hauptsächlich aus der DNA bindenden Domäne des großen T Antigens besteht. Ein monoklonaler Antikörper gegen die N-terminalen 59 Aminosäuren des großen T Antigens erkannte das Konjugat nicht, was darauf hindeutet, dass ein N-terminaler Teil verloren ist. Das große T Antigen Fragment konnte nicht mit der FAT10-Mutante interagieren, der das C-terminale Diglycin-Motif fehlt.
Zusammenfassend kann man sagen, dass die Ergebnisse, die in dieser Doktorarbeit vorgestellt wurden, ein zweites Ubiquitin-aktivierendes Enzym identifizieren und Einblicke in den Konjugierungsweg von FAT10 geben. Darüber hinaus stärken die Ergebnisse die Rolle von FAT10 in dem Abbau von Substraten und zeigen einen autoregulatorischen Prozess der FAT10-Konjugierung mit der Hilfe von NUB1L auf. Die Erkenntnisse bilden eine gute Grundlage, um FAT10 Substrate zu identifizieren und die physiologische Rolle von FAT10 in der Immunantwort aufzuklären.