The catalytically active Klenow fragment of an evolved Thermus aquaticus DNA polymerase I (KlenTaq) with enhanced substrate specificity was structurally investigated during this Ph.D. thesis. The wild-type KlenTaq is not able to amplify DNA damages like abasic sites or 8-oxo guanine and exhibits no lesion bypass activity. An evolved Thermus aquaticus (Taq) DNA polymerase with an exchange of a hydrophobic methionine to a cationic lysine at position 747 was achieved in the AG Marx and described in detail by C. Gloeckner. This single amino acid mutation led to an enzyme which can process such damaged DNA. Patel et al. found in the KlenTaq a mutation at a different position, I614K, which interestingly exhibits similar properties. This mutant was integrated in the KlenTaq M747K mutant and characterized by C. Gloeckner. This KlenTaq M747K, I614K mutant possessed a better lesion bypass ability combined with a high processivity.
The aim of this work in structural biology was to explain the differences between the functional properties of the mutated protein and the wild-type. Therefore, the proteins were crystallized and measured at the synchrotron, either the European Synchrotron Radiation Facility, ESRF, in Grenoble, France, or the Swiss Light Source, SLS, in Villigen, Switzerland.
A resolution of up to 1.7 Å was obtained in this work. Until now, this is the highest resolution achieved for the Klenow fragment of the Thermus aquaticus DNA polymerase I. One structure of the KlenTaq in the open, uncomplexed form, three structures in the closed form in complex with primer/template and dideoxynucleotidetriphosphate (ddNTP) and two structures in the closed form in complex with primer/abasic template and ddNTP were solved.
The structures reveal, that the higher positive charge of the polymerase at position 747 obviously results in a tighter binding of the DNA. This stronger positive potential is also observed in the translesion bypass polymerases (e.g. DPO4 - polymerase), whereas the family I DNA polymerases exhibit a less stronger positive potential in the DNA binding region. Moreover, a hydrogen bond network could be observed, which is absent in the wild-type. This also seems to contribute to a tighter binding of the protein to the template.
Interestingly, in the structure of the KlenTaq M747K, I614K in complex with p/t and ddATP there is again a nonpolar to cationic exchange from isoleucine to lysine at position 614.
Lysine 614 interacts with a hydrogen bond network with motif C and motif C is responsible for the binding of the metal ions, which are responsible for the incorporation of the triphosphate and for the dephosphorylation step. This interaction seems to trap the binding pocket in a more open conformation. In the KlenTaq M747K, I614K structure, bound to a stabilized abasic site template, this hydrogen bond network was visible, too, and the phenyl ring of tyrosine 671 is in the position of the absent coding base of the template. Opposite this tyrosine, an adenosintriphosphate is bound to the incorporation site via a hydrogen bond and base stacks between the adjacent nucleobase of the 3'- end of the primer and F667 from the protein. This is the first time, that such an incorporation opposite an abasic site was ever observed in a crystal structure. Soaking experiments with ddGTP instead of the bound ddATP led to a structure, where the guanosine is incorporated opposite the abasic site. The incorporated guanosine is hydrogen bonded to glutamate 615, while the adenosine hydrogen bonds to aspartate 785. The ten times higher rate of incorporation of adenosine compared to guanosine may be due to intrinsic properties of these purines. The better solvation of adenosine together with the lower hydration energy and the superior base stacking explains the higher incorporation rate compared with guanosine. Moreover, replicative polymerases enclose at the 3'- end of the DNA primer adenosine overhangs following the A-rule. The A-rule can also be explained by the tyrosine mimicking pyrimidine.

Im Rahmen dieser Doktorarbeit ist das katalytisch aktive Klenowfragment einer evolvierten Thermus aquaticus DNA-Polymerase I (KlenTaq) strukturell untersucht worden. Die Wildtyp KlenTaq ist nicht in der Lage abasische Stellen oder 8-oxo Guanine zu überlesen und hat keine Schadenüberlesefunktion. Diese evolvierte Thermus aquaticus (Taq) DNA-Polymerase mit einem einzigen Aminosäureaustausch von einem hydrophoben Methionin zu einem kationisch geladenen Lysin an Position 747 ist von der AG Marx gewonnen und detailliert von C. Gloeckner beschrieben worden. Diese Aminosäuremutation führt nun dazu, dass solche DNA Schäden überlesen werden können. Nachdem Patel et al. ebenfalls eine Mutante, die KlenTaq I614K, mit ähnlichen Eigenschaften gefunden hat, ist diese Mutation in die KlenTaq M747K von C. Gloeckner eingebaut und von ihm charakterisiert worden. Diese KlenTaq M747K, I614K Polymerase hat eine hohe Prozessivität und ist in der Lage, DNA Schäden besser zu überlesen.
Das Ziel dieser Arbeit in der Strukturbiologie bestand darin, anhand der Struktur des Proteins das spezifische Verhalten des evolvierten Proteins im Vergleich zum Wildtyp zu erklären. Dazu wurden die Proteine kristallisiert und entweder am European Synchrotron Radiation Facility, ESRF in Grenoble, Frankreich oder am SwissLightSource, SLS in Villigen, Schweiz gemessen. Auflösungen bis zu 1.7 Å sind in dieser Arbeit erreicht worden. Bisher ist dies die höchste bekannte Auflösung des Klenowfragments der Thermus aquaticus DNA-Polymerase I. Eine Struktur der KlenTaq in der offenen ungebundenen Form sowie drei verschiedene Strukturen in der geschlossenen, an Primer/Template (p/t) und Didesoxynucleotidtriphosphat (ddNTP) gebundenen Formen sowie zwei an p/abasischem Template und ddNTP gebundenen Formen konnten bestimmt werden.
Die Strukturen zeigten, dass die stärkere positive Ladung an Position 747 der Polymerase offensichtlich zu einer stärkeren Bindung der DNA führt. Das stärkere positive Potential kann auch bei den Translesion bypass''- Polymerasen beobachtet werden (z.B. DPO4 - Polymerase), wohingegen die DNA-Polymerasen der Familie I in der Interaktionsfläche schwächer positiv geladen sind. Darüberhinaus ist ein Wasserstoffbrückennetzwerk entdeckt worden, welches im Wildtyp nicht existiert. Dies kann auch zu einer stärkeren Bindung des Proteins zum Template beitragen. In der Struktur der KlenTaq M747K, I614K im ternären Komplex mit p/t und ddATP ist interessanterweise an dem kationischen Austausch von Isoleucin zu Lysin an Position 614, was wiederum ein unpolarer zu kationischer Austausch ist, ebenfalls ein stabilisierender Effekt zu Motif C entdeckt worden. Ein Wasserstoffbrückennetzwerk existiert vom Lysin 614 zu Motiv C, welches an der Bindung der Metallionen für den Einbau des Triphosphates und der Dephosphorylierung verantwortlich ist. In der Struktur der KlenTaq M747K, I614K im ternären Komplex mit Primer und Template mit abasischer Stelle ist die Wasserstoffbrückenbindung ebenfalls zu Motiv C erhalten. Es scheint, als würde damit die Aktive Tasche geöffnet bleiben, indem die Flexibilität des Motiv Cs durch die Wasserstoffbrückenbindung eingeschränkt wird. Das Tyrosin 671 übernimmt bei dem Template mit der abasischen Stelle die Position der normalerweise hier befindlichen kodierenden Base. Gegenüber diesem Tyrosin bei der Cokristallisation mit ddATP wird über Wasserstoffbrücken ein Adenosintriphosphat eingebaut. Dies ist das erste Mal, dass ein Einbau gegenüber einer abasischen Seite in der Kristallstruktur gesehen werden konnte. Soakingexperimente von ddATP gebundenen Kristallen mit ddGTP hat zur Struktur geführt, in der das Guanosin ebenfalls gegenüber der abasischen Stelle gebunden ist. Bei dem Einbau des Guanosins findet eine weitere Interaktion des Guanosins mit Glutamat 615 über eine Wasserstoffbrücke statt, im Vergleich zur Adenosin gebundenen Struktur, bei der eine Wasserstoffbrücke von Adenosin zu Aspartat 785 stattfindet. Die 10 fach höhere Einbaurate von einem Adenosin gegenüber einem Guanosin könnte durch die intrinschen Eigenschaften, die bessere Solvatisierung und somit eine niedrigere Hydrationsenergie auf Grund der um einen Ladungsparter geringeren sowie der besseren Basenstaffellung von Adenosin gegenüber Guanosin erklärt werden. Darüber hinaus werden bei replikativen Polymerasen am 3'-Ende des DNA primers Adenosin- Überhänge angefügt nach der A-rule, die mit dem einklappenden Tyrosin ebenfalls erklärt werden können.