Transkriptomanalyse von Escherichia coli unter Kohlenhydrat-Limitierung mittels DNA-Microarrays

Abstract

Escherichia coli weist unter Glukose-Limitierung (Konzentrationen unter 0,05 g/L) zahlreiche physiologische Veränderungen auf. Man unterscheidet die ppGpp-vermittelte Stringente Kontrolle, die cAMP/CRP-vermittelte Hungerantwort, die Cra-vermittelte Antwort zur Anpassung des Kohlenstoffflusses sowie die sogenannte "Starvation". Eine eindeutige Differenzierung der verschiedenen Stressantworten in E. coli unter Glukose-Limitierung sowie deren zeitliche Zuordnung ist bisher aufgrund methodischer Schwierigkeiten nicht hinreichend möglich. In diskontinuierlichen Batch-Kultivierungen verläuft speziell die Hungerantwort, begleitet durch das rasche Abfallen der Wachstumsrate, zeitlich eng begrenzt und ist somit experimentell schwer zu erfassen. Ziel der vorliegenden Dissertation war eine genauere Charakterisierung der physiologischen Antwort von E. coli auf eine Glukose-Limitierung. Die Anpassung der Zelle sollte auf Transkriptom-Ebene mit Hilfe von eigens hergestellten gesamtgenomischen DNA-Microarrays analysiert werden. Die Zellproben wurden aus drei Fermentationen gewonnen. Die Glukose-Limitierung wurde durch eine gekoppelte Batch/Fed-Batch-Prozessführung mit konstanter Zulaufrate ausgelöst und erlaubte eine Probenentnahme bei stetig sinkender Wachstumsrate sowie die Kontrolle verschiedener Parameter wie der Glukose-Konzentration, des pH-Wertes und der O2/CO2-Konzentration. Über einen Zeitraum von etwa neun Stunden wurden acht verschiedene Kulturproben unter Glukose-Limitierung sowie eine Probe aus der unlimitierten Wachstumsphase als Referenzprobe entnommen und Expressionsanalysen über DNA-Microarrays durchgeführt. Eine statistische Analyse der dabei erzeugten Daten ergab signifikante Unterschiede für 962 Transkripte unter Glukose-limitierten Bedingungen im Vergleich zur Referenz in mindestens einem Zeitpunkt. 367 der 962 Transkripte kodierten für hypothetische Proteine bzw. Proteine mit noch unbekannter Funktion. Die Gene der übrigen 595 Transkripte konnten verschiedenen physiologischen Funktionen (Anabolismus, Katabolismus, Zentraler Kohlenstoffwechsel, Transport, Proteinbiosynthese, Zellteilung, Stressantwort, Flagellen- und Chemotaxis System, Regulation sowie weitere Proteine) zugeordnet werden. Um Aussagen über aktive Regulatoren unter Kohlenhydrat-Limitierung zu machen, wurde deren regulatorische Aktivität in der vorliegenden Arbeit indirekt bestimmt. Die potentielle regulatorische Aktivität sechs verschiedener Sigma-Faktoren sowie weiterer 28 Regulatoren konnte nachgewiesen werden. Folgendes Bild über die Anpassung von E. coli auf eine Glukose-Limitierung kann aus den Ergebnissen abgeleitet werden: Unter Glukose-Limitierung induzierten die Zellen innerhalb der ersten Stunden eine cAMP/CRP- sowie Cra-vermittelte Hungerantwort. Ferner wurden Gene zur Umsetzung von Acetyl-CoA verstärkt transkribiert. Glykolytische Enzyme hingegen wurden größtenteils vermindert transkribiert. Die Zelle passte ihren Stoffwechsel also den verminderten Glukose-Konzentrationen im umgebenden Medium an. In der Hungerphase wurde interessanterweise trotz einer ausreichenden Ammoniumkonzentration im Medium ein physiologischer Zustand beobachtet, der einer Stickstoff-Limitierung ähnelt. Die drei, unter Stickstoff-Limitierung aktiven Systeme in E. coli (NtrC, Nac sowie SigmaN vermittelte Reaktionen) wurden aktiviert. Möglicherweise stellt diese Reaktion neben der cAMP/CRP-vermittelten Antwort eine weitere Möglichkeit für E. coli dar, Kohlenstoffquellen zu erschließen, da die Kohlenstoffgerüste zahlreicher Aminosäuren zur Energiegewinnung oxidiert werden können. Unter Glukose-Limitierung konnte ferner über den gesamten betrachteten Zeitraum eine der Stringenten Kontrolle zuzuordnende differentielle Expression beobachtet werden. Entgegen den Erwartungen wurde vorwiegend eine herabgesetzte Synthese der mRNA für Enzyme der Aminosäurebiosynthese nachgewiesen. Weiterhin war die Stringente Kontrolle nicht an eine Regulation der Physiologie durch SigmaS gekoppelt. Zu einem späteren Zeitpunkt unter Kohlenstoff-Limitierung synthetisierten die Zellen trotz ausreichender Sauerstoff-Konzentration im Bioreaktor mRNA, die für anaerobe Enzyme kodiert. Dies spricht für eine Zell-Antwort, die normalerweise unter anaeroben Bedingungen beobachtet werden kann. Vermittelt wurde diese Zell-Antwort möglicherweise durch das Fermentations/Atmungs-Umschaltprotein (FrsA) welches auf einen veränderten Glukose-Transport reagiert und der Zelle ein Umschalten zwischen Fermentation und Atmung ermöglicht. Die vorliegenden Ergebnisse lassen auf ein Umschalten des Proteins auch zwischen aerober Atmung und anaerober Atmung schließen. Die Microarray-Analyse ergab weiterhin Hinweise auf die Regulation verschiedener Proteine unter Kohlenhydrat-Limitierung, die bisher als nicht reguliert galten bzw. entgegen der erwarteten Regulation reguliert wurden.

Escherichia coli shows several physiological adaptations due to glucose limitation (concentrations below 0.05g/L). These are the ppGpp mediated stringent response, the cAMP/CRP mediated hunger response, the regulation by the Cra regulon which fits the glucose flow with limited glucose concentrations, and the starvation, respectively. Due to methodical problems, it was impossible to assign the above mentioned stress responses in E. coli affected by glucose limitation in a time scale and to differentiate them. In discontinuous batch fermentations the different stages of a glucose limitation induced stress response are run through quickly. In particular, due to the fast dropping gowth rate in such fermentations, the hunger response is temporally restricted and therefore difficult to access for experimental evaluation. The aim of this thesis was a more precise characterization of E. colis' stress response induced by glucose limitation. A transcription profiling with custom made whole genome DNA microarrays was carried out. Culture samples were collected from three fermentations. The glucose limitation in E. coli was induced by a coupled batch/fed batch process control with constant feed in the fed batch phase and allowed a sampling during a slow dropping growth rate. Further, it gave the possibility to control several parameters like glucose concentration, pH value as well as CO2 and O2 concentrations. Over a period of approximately nine hours eight samples were taken during glucose limitation and a refernce sample was taken during the unlimited growth phase. Expression analysis with DNA microarrays was performed. The statistical analysis of the generated data showed significant differences between the glucose limited samples and the unlimited reference sample for 962 transcripts for at least one point of time. 367 of these transcripts coded for hypothetical proteins or for proteins of unknown function. The other 595 transcripts could be assigned to several physiological functions (anabolism, catabolism, central carbon metabolism, transport, protein biosynthesis, cell division, stress response, flagellar and chemotaxis system, regulation as well as other proteins). An indirect analysis of regulators was performed for the significant differentially transcribed genes in this thesis. The potential regulatory activity of six Sigma factors as well as 28 regulators were identified. The following picture can be derived from the results: Glucose limited cells induced a cAMP/CRP as well as a Cra mediated hunger response. Genes for the metabolism of acetyl-CoA were regulated up. Glycolytic enzymes were regulated down. The cell adjusted its metabolism according to the decreased glucose concentration in the surrounding medium. Within the hunger phase an interesting physiological state was observed. Although there was enough ammonium in the medium the cell behaved as being limited for nitrogen. Three systems active during nitrogen limitation were activated. These systems are coordinated by the regulatory proteins NtrC, Nac, as well as Sigma N. The observed nitrogen stress response led to the transcription of genes for several amino acid transport systems meaning it enabled the cell to induce transport proteins for amino acids. Perhaps, this reaction is another possibility for E. coli to acquire carbon sources during limitation besides the cAMP/CRP mediated hunger response. The carbon scaffolding of many amino acids can be oxidized for energy generation. During glucose limitation, a stringent controlled transcription could be proven for the whole period of time. Contrary to expectations a decreased mRNA synthesis of amino acid biosynthesis enzymes could be shown. Furthermore, the stringent response was not coupled to a regulation by Sigma S. Although there was enough oxygen available during the fermentation process, mRNA coding for enzymes usually active during anaerobic conditions was synthesized after four hours of limitation. As the results indicate, this reaction could have been mediated by the fermentation respiration switch protein (FrsA) which reacts to the decreased glucose transport. FrsA enables the cell to switch between fermentation and respiration. The obtained results suggest that FrsA is also able to switch between aerobic respiration and anaerobic respiration. Additionally, the microarray analysis gave hints on the regulation of proteins due to glucose limitation which were expected to be regulated in different ways.