Carotinoid-Biosynthese und Carotinoid-Spaltung in Escherichia coli und Pseudomonas putida mittels heterologer Genexpression

Abstract

Für die heterologe Produktion von Carotinoiden mit Escherichia coli wurde ein pBBR1MCS-2- und pBR322-basiertes Zwei-Plasmid-Expressionssystem mit L-Rhamnose-induzierbaren Promotoren konstruiert. Die verwendeten Carotinoid-Biosynthesegene stammen aus Pantoea ananatis, Brevundimonas sp. SD212 und Corynebacterium glutamicum. Mit den hergestellten Vektoren können die C40-Carotinoide Lycopin, beta-Carotin, Zeaxanthin, Canthaxanthin und Astaxanthin sowie die C50-Carotinoide Sarcinaxanthin, Sarprenoxanthin und Decaprenoxanthin produziert werden. Die Carotinoid-Ausbeuten mit Escherichia coli JM109 betrugen ca. 1 mg Carotinoid pro Gramm Zelltrockenmasse. Durch den Einsatz des Escherichia coli Stammes WA66.1 xthA konnte im Vergleich zu Escherichia coli JM109 die Carotinoid-Ausbeute beträchtlich gesteigert werden. Der Stamm produzierte 4,5 mg Lycopin pro Gramm Zelltrockenmasse. Die bessere Eignung des Stammes beruht möglicherweise auf seiner Unfähigkeit zur L-Rhamnose-Verwertung. Durch die heterologe Expression von Genen aus dem Mevalonat-Stoffwechselweg von Saccharomyces cerevisiae und eine gleichzeitige Mevalonat-Zugabe konnte die Carotinoid-Produktion mit Escherichia coli WA66.1 xthA auf 11,4 mg Lycopin pro Gramm Zelltrockenmasse gesteigert werden. Pseudomonas putida KT2440 wurde hinsichtlich seiner Eignung als Produktionsstamm für Carotinoide getestet. Die Untersuchungen zeigten, dass Lycopin auf Pseudomonas putida KT2440 toxisch wirkt und dieser Stamm daher grundsätzlich nicht besonders gut für die heterologe Carotinoid-Produktion geeignet ist. Durch eine Transposon-Mutagenese konnten Mutanten mit erhöhter Lycopin-Toleranz isoliert werden. Die Identifizierung der von der Integration der Transposons betroffenen Gene brachte jedoch keine ausreichenden Erkenntnisse für ein Verständnis der individuellen Mechanismen, die der Verringerung der Lycopin-Toxizität zugrunde liegen. In der Genomsequenz von Sphingopyxis alaskensis RB2256 wurden durch eine Datenbanksuche die mutmaßlichen Carotinoid-Biosynthesegene crtE, crtB, crtI, crtY, crtZ und crtG gefunden. Die Analyse des von Sphingopyxis alaskensis RB2256 produzierten Hauptcarotinoids mittels HPLC, Massenspektrometrie und Photometrie ergab, dass es sich höchstwahrscheinlich um Nostoxanthin handelt. Die funktionelle Charakterisierung des mutmaßlichen CrtG von Sphingopyxis alaskensis RB2256 mittels HPLC konnte dessen Identität als beta-Endgruppen-C2,C2'-Hydroxylase bestätigen. Die heterologe Produktion von Nostoxanthin als Hauptcarotinoid mit Escherichia coli ist jedoch nicht gelungen. Die funktionelle Charakterisierung der mutmaßlichen Carotinoid-Biosynthesegene crtC, crtU und crtY von Plesiocystis pacifica SIR-1 mittels HPLC, Massenspektrometrie und Photometrie ergab, dass diese eine psi-Engruppen-C1,C1'-Hydroxylase, beta-Carotin-Desaturase und Lycopin-beta-Cyclase kodieren. Mit Hilfe von crtC und crtU wurde das Zwei-Plasmid-Expressionssystem erweitert. Dadurch konnten mit Escherichia coli JM109 zusätzlich Hydroxylycopin, Dihydroxylycopin und Isorenieratin produziert werden. Die Carotinoid-Oxygenase Sala_1698 aus Sphingopyxis alaskensis RB2256 spaltet monocyclische und acyclische Substrate. Durch die heterologe Expression von sala_1698 in Carotinoid-produzierenden Escherichia coli JM109 Stämmen wurde eine Spaltaktivität von Sala_1698 für Lycopin, Hydroxylycopin und Dihydroxylycopin nachgewiesen. Das Enzym wurde mittels Strep-Tactin Sepharose aufgereinigt und durch in vitro Umsetzungen von Apo-8'-carotinal genauer charakterisiert. Sala_1698 war in einem pH-Bereich von 7,0 bis 9,6 gleichbleibend aktiv. Das Temperaturoptimum des Enzyms liegt zwischen 30 und 40 °C. Durch die Analyse der Apo-8'-carotinal-Spaltprodukte mittels Massenspektrometrie und Photometrie wurden zwei Schnittpositionen an den 9'/10'- und 11'/12'-Doppelbindungen identifiziert. Es blieb jedoch ungeklärt, ob die die Spaltung durch Sala_1698 an den identifizierten Positionen unpräzise oder sukzessiv erfolgt. Die Carotinoid-Oxygenase Ppsir1_15490 aus Plesiocystis pacifica SIR-1 spaltet Carotinoide mit Hydroxygruppen und/oder Ketogruppen. Durch die heterologe Expression von ppsir1_15490 in Carotinoid-produzierenden Escherichia coli JM109 Stämmen wurden die C40-Carotinoide Dihydroxylycopin und Zeaxanthin sowie die C50-Carotinoide Sarcinaxanthin, Sarprenoxanthin und Decaprenoxanthin als Substrate für Ppsir1_15490 identifiziert. Die Expression des GC-reichen Gens in Escherichia coli wurde durch die Mutagenese der ersten vier Codons nach dem Startcodon verbessert (ppsir1_15490mut). Durch die Umsetzung von verschiedenen Carotinoiden mit ppsir1_15490mut-überexprimierenden, ganzen Zellen von Escherichia coli JM109 konnte die Spaltaktivität von Ppsir1_15490 für Zeaxanthin bestätigt und darüber hinaus auch Spaltaktivitäten für Nostoxanthin, Canthaxanthin und Astaxanthin gemessen werden. Die Analyse der Spaltprodukte mittels Massenspektrometrie zeigte, dass das Enzym Zeaxanthin, Nostoxanthin und Canthaxanthin unpräzise an den 11'/12'- oder 13'/14'-Doppelbindungen spaltet.Astaxanthin hingegen wird von Ppsir1_15490 präzise an der 13'/14'-Doppelbindung gespalten.

An L-rhamnose-inducible two plasmid expression system based on the replicons pBBR1MCS-2 and pBR322 was constructed for the heterologous production of carotenoids in Escherichia coli. The cloned carotenoid biosynthesis genes originate from Pantoea ananatis, Brevundimonas sp. SD212 and Corynebacterium glutamicum. The constructed vectors were applied for the production of the C40 carotenoids lycopene, beta-carotene, zeaxanthin, canthaxanthin and astaxanthin and also the C50 carotenoids sarcinaxanthin, sarprenoxanthin and decaprenoxanthin. Plasmid-carrying Escherichia coli JM109 strains produced about 1 mg carotenoid per gramme cell dry weight. Compared to Escherichia coli JM109, the carotenoid yields obtained with Escherichia coli WA66.1 xthA were considerably higher. The strain produced 4.5 mg lycopene per gramme cell dry weight. The superior applicability of Escherichia coli WA66.1 xthA for carotenoid production is possibly due to its inability to use L-rhamnose as a carbon source. Lycopene production with Escherichia coli WA66.1 xthA was improved by heterologous expression of genes from the mevalonate pathway of Saccharomyces cerevisiae andsimultaneous addition of mevalonate, thereby producing 11.4 mg lycopene per gramme cell dry weight. Pseudomonas putida KT2440 was tested as a host for heterologous carotenoid production. The investigations revealed that lycopene is toxic to Pseudomonas putida KT2440 and the strain is therefore generally not a proper host for the heterologous production of carotenoids. Lycopene-tolerant mutants could be isolated by employing transposon mutagenesis. However, the identification of the genes affected by the transposon integration gave no sufficient evidences for the comprehension of the individual mechanisms that underlie the reduction of lycopene toxicity. A database search revealed the presence of the putative carotenoid biosynthesis genes crtE, crtB, crtI, crtZ and crtG in the genome sequence of Sphingopyxis alaskensis RB2256. Analyses with HPLC, mass spectrometry and photometry revealed that the major carotenoid pigment of Sphingopyxis alaskensis RB2256 is most likely nostoxanthin. Functional characterization of putative CrtG by HPLC could confirm its identity as a beta-end group C2,C2' hydroxylase. However, the heterologous production of nostoxanthin as the predominant carotenoid in Escherichia coli JM109 failed. Functional characterization of the putative carotenoid biosynthesis genes crtC,crtU and crtY from Plesiocystis pacifica SIR-1 with HPLC, mass spectrometry and photometry revealed that the genes encode a psi-end group C1,C1' hydroxylase, a beta-carotene desaturase and a lycopene beta-cyclase, respectively. Extension of the two-plasmid expression system with crtC and crtU enabled the additional production of hydroxy lycopene, dihydroxy lycopene and isorenieratene with Escherichia coli JM109. The carotenoid oxygenase Sala_1698 from Sphingopyxis alaskensis RB2256 cleaves monocyclic and acyclic substrates. Heterologous expression of sala_1698 in carotenoid-producing Escherichia coli JM109 strains revealed cleavage activity of Sala_1698 for lycopene hydroxy lycopene and dihydroxy lycopene. The enzyme was purified with Strep-Tactin sepharose and further characterized by in vitro studies on apo-8'-carotenal cleavage. Enzyme activity was constant at pH values between 7.0 and 9.6. The temperature optimum of Sala_1698 lies between 30 and 40 °C. By analysing the cleavage products of apo-8'-carotenal with mass spectrometry and photometry, two cleavage sites at the 9'/10' and 11'/12' double bonds could be identified. However, it remained unresolved whether the cleavage of apo-8'-carotenal by Sala_1698 occurs imprecisely or successively. The carotenoid oxygenase Ppsir1_15490 from Plesiocystis pacifica SIR-1 cleaves substrates with hydroxy and/or keto groups. Heterologous expression of ppsir1_15490 in carotenoid-producing Escherichia coli JM109 strains revealed cleavage activity of Ppsir1_15490 for the C40 carotenoids dihydroxy lycopene and zeaxanthin and also the C50 carotenoids sarcinaxanthin, sarprenoxanthin and decaprenoxanthin. The expression of the GC-rich ppsir1_15490 in Escherichia coli was improved by mutagenesis of the first four codons following the initiation codon (ppsir1_15490mut). Whole cells of ppsir1_15490mut-overexpressing Escherichia coli JM109 were applied for the conversion of different carotenoids. Thereby, cleavage activity of Ppsir1_15490 for zeaxanthin was confirmed and furthermore cleavage activities for nostoxanthin, canthaxanthin and astaxanthin were detected. Analysis of the cleavage products with mass spectrometry revealed, that the enzyme cleaves zeaxanthin, nostoxanthin and canthaxanthin imprecisely at the 11'/12' or 13'/14' double bonds. Astaxanthin is cleaved precisely by Ppsir1_15490 at the 13'/14' double bond.