PUB - Publikationen an der Universität Bielefeld

Zusammenfassung In vorausgegangenen Arbeiten über das Verhalten temperaturresistenter (tr) und temperatursensitiver (ts) Tabakmosaikvirus-Hüllproteine (TMV-HP) im Pflanzengewebe war gezeigt worden, dass denaturierte, unlösliche Hüllproteine zu einer deutlichen Ubiquitin- Reaktion im Sediment der Extrakte infizierter Pflanzen führen. Die Verschiebung des isoelektrischen Punktes der Ubiquitin-positiven Proteine bei der Verwendung von TMV-HPMutanten mit Ladungsaustauschen zeigte, dass das Hüllprotein das hauptsächliche Ziel der Ubiquitinierung ist (Jockusch, H., Wiegand, C., FEBS Lett.;545:229-232,2003). In der folgenden Arbeit wurde untersucht, wie tierische Zellen auf fehlgefaltetes TMV-HP reagieren. Dazu wurden die cDNAs tr und ts Mutanten des TMV-HP in einem Expressionsvektor transient in Säugerzellen (Neuro2a und Cos7) transfiziert und die Zustandsformen der TMV-HPs und die Reaktion der Zelle darauf untersucht. Die Bedeutung der Prolinreste (P) im TMV-HP für seine Stabilität wurde durch den Austausch von P gegen Leucin (PnL) an den acht möglichen Positionen (n) analysiert. Zur Steigerung der Sensitivität des HP-Nachweises wurde an dessen C-Terminus eine zehn Aminosäuren lange Markierungssequenz aus Birkenpollenprofilin angehängt, die mit einem monoklonalen Antikörper nachgewiesen wurde (Rüdiger, M., et al., Biotechniques 23, 96-7 (1997). Diffus in der Säugerzelle verteiltes, freies ts TMV-HP aggregiert nach Erhöhung der Inkubationstemperatur innerhalb von wenigen Stunden. Die Aggregate enthalten das Hitzeschockprotein HSP70 und zeigen eine positive Ubiquitin-Reaktion. Das Temperaturverhalten von Wildtyp und ts HPs in der tierischen Zelle ist ähnlich wie in der Pflanzenzelle. Die Denaturierungstemperatur liegt aber in der tierischen Zelle in einigen Fällen höher als im pflanzlichen Gewebe. Die Anzahl HP-positiver Zellen steigt nach der Transfektion bei einer Inkubationstemperatur von 30 °C im Lauf von 48 Stunden an. Bei 37 °C ist die Zahl der TMV-HP positiven Zellen wesentlich geringer, die Zahl aktivierter Caspase 3 (cCasp3) positiver und HP positiver Zellen höher als bei 30 °C, was auf einen pathogenen Einfluss der Fremdproteine schließen lässt. Die durch Immunblot gemessene Konzentration cCasp3 in Säugerzellextrakten war in mit HP-cDNA transfizierten Zellen im Vergleich zu mit GFP transfizierten oder nicht transfizierten Zellen erhöht. Lysin-freie HP einiger Mutanten und des Wildtyps vulgare aggregieren mehr oder weniger stark. Zusammen mit diesen Aggregaten wurde eine etwas schwäche Ubiquitin-Kolokalisation als bei den entsprechenden Lysin-haltigen HP beobachtet. Wurde der Proteasominhibitors MG132 dem Transfektionsansatz zwei Tage nach der Transfektion zugesetzt, stieg die Zahl der HP- und GFP-produzierenden Zellen stärker an als im Kontrollansatz ohne Inhibitor. Die Inhibierung der Proteasome führt in den Zellen, die lösliches HP oder GFP produzieren zu einer stärkeren Apoptose als in den Zellen, in denen das TMV-HP aggregiert war. Die Untersuchungen an TMV-HP-transfizierten Säugerzellen ergaben: - Im Pflanzengewebe temperatursensitive HPs sind auch in Säugerzellen ts. - Aggregate aus ts TMV-HP sind positiv für Ubiquitin, auch wenn das HP kein Lysin enthält. Demnach scheinen ubiquitinierte zelluläre Proteine mit dem TMV-HP zu koaggregieren. - Die Konzentration der cCasp.3 steigt in den mit TMV-HP-cDNA transfizierten Zellen an, die Anhäufung des Fremdproteins induziert apoptotische Prozess.